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Navegação por Autores IPEN "PRATA, BEATRIZ A."
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SANTOS, CAROLINA M. dos
; SAMPAIO, SUELEN de B.; SANTANA, FAGNER
; LEITE, RODRIGO C.
; PRATA, BEATRIZ A.
; AFFONSO, REGINA
.
A new approach for purification of the catalytic site of the Angiotensin Conversion Enzyme, N domain, mediated by the ELP-Inten system.
Biophysical Reviews,
v. 13,
n. 6,
p. 1305-1305,
2021.
DOI:
10.1007/s12551-021-00845-2
Abstract:
INTRODUCTION
Angiotensin-converting enzyme I, ACE, is a key part of the
renin-angiotensin system whose main function is to regulate blood pressure
and balance of salts in the body. ACE1 has two isoforms, somatic,
sACE, and testicular, tACE. sACE possesses two domains, N- C-, with
catalytic sites which exhibit 60% sequence identity. These domains differ
in terms of chloride-ion activation profiles, rates of peptide hydrolysis and
sensitivities to various inhibitors. N-domain has specific action in the
hydrolyze of Alzheimer’s diseases beta amyloid bodies and angiotensin
1-7, which active the MAS receptor and triggering anti-thrombotic and
anti-inflammatory actions.
OBJECTIVES
The objective this work was to obtain catalytic site Ala361 to Gli468 of
the N-domain region, csACEN, isolation without chromatographic and
denaturant chemical process.
MATERIALS AND METHODS
For that, a new methodology was used in the expression of the csACEN
peptide, in which the peptide was linked to the elastin-like polypeptide,
ELP, and Intein, and expressed at 37C. The characterization of catalytic
site was made by SDS-PAGE and dot blotting.
DISCUSSION AND RESULTS
The culture temperature at 37C significantly increased the expression of
the ELP/Intein/csACEN fusion protein. This culture was lysed at a low
temperature allowing the fusion protein to become soluble. The precipitation
of ELP at high concentrations of ammonium sulfate were obtained
in 0.57 M and 0.8 M. Intein autocleavage occurs at acidic pH and it is
important to pay attention to: pI 6.65 for csACEN and pI 6.87 for
ELPcsACEN, which are very low. The best autocleavage efficiency
was withMES and TriHCl buffers, pH 6.3 and 6.8, respectively, in which
pure csACEn peptide was obtained.
CONCLUSION
The strategy used to obtain the Ala361 to Gli468 catalytic site in soluble
and pure form was obtained with success and the protocol for obtaining
similar peptides was established.
SANTOS, CAROLINA M. dos; SAMPAIO, SUELEN de B.; SANTANA, FAGNER; LEITE, RODRIGO C.; PRATA, BEATRIZ A.; AFFONSO, REGINA.
A new approach for purification of the catalytic site of the Angiotensin Conversion Enzyme, N domain, mediated by the ELP-Inten system.
Biophysical Reviews,
v. 13,
n. 6,
p. 1305-1305,
2021.
DOI:
10.1007/s12551-021-00845-2.
Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/32883. Acesso em: $DATA.
Esta referência é gerada automaticamente de acordo com as normas do estilo IPEN/SP (ABNT NBR 6023) e recomenda-se uma verificação final e ajustes caso necessário.
Como referenciar este item
-
SANTOS, CAROLINA M. dos
; SAMPAIO, SUELEN de B.; SANTANA, FAGNER
; LEITE, RODRIGO C.
; PRATA, BEATRIZ A.
; AFFONSO, REGINA
.
A new approach for purification of the catalytic site of the Angiotensin Conversion Enzyme, N domain, mediated by the ELP-Inten system.
In: CONGRESS OF THE INTERNATIONAL UNION FOR PURE APPLIED BIOPHYSICS, 20th; ANNUAL MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, 50th; CONGRESS OF BRAZILIAN BIOPHYSICS SOCIETY, 45th; BRAZILIAN SOCIETY ON NUCLEAR BIOSCIENCES CONGRESS, 13th,
October 4-8, 2021,
São Paulo, SP.
Abstract...
São Paulo, SP: Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq),
2021.
p. 143-143.
Abstract:
Angiotensin-converting enzyme I, ACE, is a key part of the renin-angiotensin system whose main function is to
regulate blood pressure and balance of salts in the body. ACE1 has two isoforms, somatic, sACE, and testicular,
tACE. sACE possesses two domains, N- C-, with catalytic sites which exhibit 60% sequence identity. These domains
differ in terms of chloride-ion activation profiles, rates of peptide hydrolysis and sensitivities to various inhibitors. N-domain
has specific action in the hydrolyze of Alzheimer’s diseases beta amyloid bodies and angiotensin 1-7, which
active the MAS receptor and triggering anti-thrombotic and anti-inflammatory actions. The objective this work was to
obtain catalytic site Ala361 to Gli468 of the N-domain region, csACEN, isolation without chromatographic and
denaturant chemical process. For that, a new methodology was used in the expression of the csACEN peptide, in
which the peptide was linked to the elastin-like polypeptide, ELP, and Intein, and expressed at 37C. The
characterization of catalytic site was made by SDS-PAGE and dot blotting. The culture temperature at 37C
significantly increased the expression of the ELP/Intein/csACEN fusion protein. This culture was lysed at a low
temperature allowing the fusion protein to become soluble. The precipitation of ELP at high concentrations of
ammonium sulfate were obtained in 0.57 M and 0.8 M. Intein autocleavage occurs at acidic pH and it is important to
pay attention to: pI 6.65 for csACEN and pI 6.87 for ELPcsACEN, which are very low. The best autocleavage
efficiency was with MES and TriHCl buffers, pH 6.3 and 6.8, respectively, in which pure csACEn peptide was
obtained. The strategy used to obtain the Ala361 to Gli468 catalytic site in soluble and pure form was obtained with
success and the protocol for obtaining similar peptides was established.
Palavras-Chave:
angiotensin;
enzymes;
inflammation;
thrombosis;
temperature dependence
SANTOS, CAROLINA M. dos; SAMPAIO, SUELEN de B.; SANTANA, FAGNER; LEITE, RODRIGO C.; PRATA, BEATRIZ A.; AFFONSO, REGINA.
A new approach for purification of the catalytic site of the Angiotensin Conversion Enzyme, N domain, mediated by the ELP-Inten system.
In:
CONGRESS OF THE INTERNATIONAL UNION FOR PURE APPLIED BIOPHYSICS, 20th; ANNUAL MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, 50th; CONGRESS OF BRAZILIAN BIOPHYSICS SOCIETY, 45th; BRAZILIAN SOCIETY ON NUCLEAR BIOSCIENCES CONGRESS, 13th,
October 4-8, 2021,
São Paulo, SP.
Abstract...
São Paulo, SP: Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq),
2021.
p. 143-143.
Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/32867. Acesso em: $DATA.
Esta referência é gerada automaticamente de acordo com as normas do estilo IPEN/SP (ABNT NBR 6023) e recomenda-se uma verificação final e ajustes caso necessário.
Como referenciar este item
-
PRATA, BEATRIZ A.
; SANTOS, CAROLINA M. dos
; AFFONSO, REGINA
.
Optimization of the process of expression in E. coli and purification of the catalytic sites of the ACE1 by the ELP-Intein system.
In: ANNUAL MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY (SBBq), 51st; CONGRESS OF BRAZILIAN BIOPHYSICAL SOCIETY (SBBf)/LATIN AMERICAN FEDERATION OF BIOPHYSICAL SOCIETIES (Lafebs), 46th,
September 5-8, 2022,
Águas de Lindóia, SP.
Abstract...
São Paulo, SP: Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular - SBBq,
2022.
p. 220-220.
Abstract:
INTRODUCTION: Angiotensin I-converting enzyme (ACE) is a fundamental part of the renin-angiotensin system; this
has two domains, N- and C-, each of which has a catalytic site that exhibits 60% sequence identity. Its actions are in
the control of blood pressure, protection of the brain by cleavage of beta-amyloid bodies, cell proliferation, formation
of hematopoietic stem cells, among others. OBJECTIVES: Obtaining the catalytic sites Ala361 to Gly468 (N domain
region, csACEN) and Ala959 to Ser1066 (C domain region, csACEC) in pure form and with their correct structural
conformation. MATERIALS AND METHODS: Expression conditions of pE1csACEN and pE1csACEC vectors in E.
coli BL21(DE3) strain: cultures grown in Terrific Broth at 37⁰C at 140 rpm for 20–24 h and 0.1 mM IPTG. Purification
by Elastin-like Polypeptide (ELP) precipitation: ELP-bound catalytic sites were purified with two ammonium sulfate
precipitations (ASp). Remotion of ELP: by autocleavage of the Intein sequence using the buffers: sodium phosphate,
sodium cacodylate, MES and Tris-HCl. The ELP/Intein was removed from the sample by ASp. The analyzes of all
stages of the process were performed by SDS-PAGE and Dot blotting. DISCUSSION AND RESULTS: The differential
for obtaining the pure peptides was the temperature of 37⁰C, with a significant increase in expression concerning the
cultivation of 16⁰C. In the ELP purification steps, ammonium sulfate buffer concentrations of 0.57 M and 0.8 M were
the most efficient. Intein's self-cleaving was more efficient with MES buffers and Tris-HCl for ELPsACEN and
ELPsACEC, respectively. Structural analysis by Circular Dichroism and Fluorescence confirmed the correct structure
of the pure peptides. CONCLUSION: In the present work, we defined the most efficient conditions for expression,
purification, and obtaining of ACE catalytic sites in pure form. The csACEN and csACEC peptides will allow greater
assertiveness in obtaining and characterizing new hypertensive drugs and in the hydrolysis of substrates such as beta-amyloid.
PRATA, BEATRIZ A.; SANTOS, CAROLINA M. dos; AFFONSO, REGINA.
Optimization of the process of expression in E. coli and purification of the catalytic sites of the ACE1 by the ELP-Intein system.
In:
ANNUAL MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY (SBBq), 51st; CONGRESS OF BRAZILIAN BIOPHYSICAL SOCIETY (SBBf)/LATIN AMERICAN FEDERATION OF BIOPHYSICAL SOCIETIES (Lafebs), 46th,
September 5-8, 2022,
Águas de Lindóia, SP.
Abstract...
São Paulo, SP: Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular - SBBq,
2022.
p. 220-220.
Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/33911. Acesso em: $DATA.
Esta referência é gerada automaticamente de acordo com as normas do estilo IPEN/SP (ABNT NBR 6023) e recomenda-se uma verificação final e ajustes caso necessário.
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O gerenciamento do Repositório está a cargo da Biblioteca do IPEN. Constam neste RI, até o presente momento 20.950 itens que tanto podem ser artigos de periódicos ou de eventos nacionais e internacionais, dissertações e teses, livros, capítulo de livros e relatórios técnicos. Para participar do RI-IPEN é necessário que pelo menos um dos autores tenha vínculo acadêmico ou funcional com o Instituto. Nesta primeira etapa de funcionamento do RI, a coleta das publicações é realizada periodicamente pela equipe da Biblioteca do IPEN, extraindo os dados das bases internacionais tais como a Web of Science, Scopus, INIS, SciElo além de verificar o Currículo Lattes. O RI-IPEN apresenta também um aspecto inovador no seu funcionamento. Por meio de metadados específicos ele está vinculado ao sistema de gerenciamento das atividades do Plano Diretor anual do IPEN (SIGEPI). Com o objetivo de fornecer dados numéricos para a elaboração dos indicadores da Produção Cientifica Institucional, disponibiliza uma tabela estatística registrando em tempo real a inserção de novos itens. Foi criado um metadado que contém um número único para cada integrante da comunidade científica do IPEN. Esse metadado se transformou em um filtro que ao ser acionado apresenta todos os trabalhos de um determinado autor independente das variáveis na forma de citação do seu nome.
A elaboração do projeto do RI do IPEN foi iniciado em novembro de 2013, colocado em operação interna em julho de 2014 e disponibilizado na Internet em junho de 2015. Utiliza o software livre Dspace, desenvolvido pelo Massachusetts Institute of Technology (MIT). Para descrição dos metadados adota o padrão Dublin Core. É compatível com o Protocolo de Arquivos Abertos (OAI) permitindo interoperabilidade com repositórios de âmbito nacional e internacional.
1. Portaria IPEN-CNEN/SP nº 387, que estabeleceu os princípios que nortearam a criação do RDI,
clique aqui.
2. A experiência do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN-CNEN/SP) na criação de um Repositório Digital Institucional – RDI,
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O Repositório Digital do IPEN é um equipamento institucional de acesso aberto, criado com o objetivo de reunir, preservar, disponibilizar e conferir maior visibilidade à Produção Científica publicada pelo Instituto, desde sua criação em 1956.
Operando, inicialmente como uma base de dados referencial o Repositório foi disponibilizado na atual plataforma, em junho de 2015. No Repositório está disponível o acesso ao conteúdo digital de artigos de periódicos, eventos, nacionais e internacionais, livros, capítulos, dissertações, teses e relatórios técnicos.
A elaboração do projeto do RI do IPEN foi iniciado em novembro de 2013, colocado em operação interna em julho de 2014 e disponibilizado na Internet em junho de 2015. Utiliza o software livre Dspace, desenvolvido pelo Massachusetts Institute of Technology (MIT). Para descrição dos metadados adota o padrão Dublin Core. É compatível com o Protocolo de Arquivos Abertos (OAI) permitindo interoperabilidade com repositórios de âmbito nacional e internacional.
O gerenciamento do Repositório está a cargo da Biblioteca do IPEN. Constam neste RI, até o presente momento 20.950 itens que tanto podem ser artigos de periódicos ou de eventos nacionais e internacionais, dissertações e teses, livros, capítulo de livros e relatórios técnicos. Para participar do RI-IPEN é necessário que pelo menos um dos autores tenha vínculo acadêmico ou funcional com o Instituto. Nesta primeira etapa de funcionamento do RI, a coleta das publicações é realizada periodicamente pela equipe da Biblioteca do IPEN, extraindo os dados das bases internacionais tais como a Web of Science, Scopus, INIS, SciElo além de verificar o Currículo Lattes. O RI-IPEN apresenta também um aspecto inovador no seu funcionamento. Por meio de metadados específicos ele está vinculado ao sistema de gerenciamento das atividades do Plano Diretor anual do IPEN (SIGEPI). Com o objetivo de fornecer dados numéricos para a elaboração dos indicadores da Produção Cientifica Institucional, disponibiliza uma tabela estatística registrando em tempo real a inserção de novos itens. Foi criado um metadado que contém um número único para cada integrante da comunidade científica do IPEN. Esse metadado se transformou em um filtro que ao ser acionado apresenta todos os trabalhos de um determinado autor independente das variáveis na forma de citação do seu nome.