Navegação por Autores IPEN "ZACARIAS, ENIO A."

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  • IPEN-DOC 28041

    ZACARIAS, ENIO A. . Comparação de eficiência entre vetores contendo a sequência genômica e complementar, acrescida ou não da região downstream, do hormônio de crescimento humano na terapia gênica / Comparison of efficiency between vectors containing the genomic and the complementary sequences, with or without the downstream region, of the human growth hormone in gene therapy . 2020. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 72 p. Orientador: Cibele Nunes Peroni. DOI: 10.11606/D.85.2020.tde-16072021-135829

    Abstract: A deficiência de hormônio de crescimento (GHD) é geralmente tratada com injeções repetidas do hormônio recombinante. Nosso grupo tem trabalhado com uma alternativa para o tratamento padrão da GHD, utilizando um modelo de terapia gênica baseado em uma única injeção de DNA plasmidial (naked DNA) contendo a sequência genômica (gDNA) do hormônio de crescimento humano (hGH). Utilizamos uma abordagem in vivo na qual o vetor de expressão é administrado em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid), seguido por eletrotransferência. Em estudos anteriores, obtivemos níveis elevados de hGH no soro desses camundongos (~ 20 ng/mL) com uma aproximação de crescimento em relação ao camundongo normal (catch-up growth) de ~ 70% para o peso corporal e de ~ 80% para o comprimento do fêmur, utilizando um vetor plasmidial contendo o gDNA do hGH com o promotor de ubiquitina-C. Por outro lado, em trabalho anterior tivemos uma indicação de que a sequência complementar (cDNA) poderia ter uma vantagem sobre o gDNA em nosso protocolo de terapia gênica. No presente trabalho, nosso objetivo foi realizar um estudo comparativo entre vetores contendo as sequências genômica (gDNA), complementar (cDNA) ou complementar acrescida da região 3' (cDNA 3') do hGH. Primeiro, os vetores foram analisados quanto aos níveis de expressão in vitro mediante transfecção de células HEK-293. Os níveis de hGH foram mensurados por ELISA e atingiram 20,96 ± 4,28 μg/mL para gDNA, 1,59 ± 0,42 μg/mL para cDNA e 3,13 ± 0,71 μg/mL para cDNA+3', após 72 h da transfecção. Uma segunda quantificação foi realizada por RP-HPLC e o padrão de expressão foi o mesmo da quantificação por ELISA. Em seguida, foram realizados bioensaios administrando esses vetores em camundongos lit/scid, via eletrotransferência, no músculo tibial anterior. O primeiro bioensaio foi de 7 dias e, ao final do experimento, os níveis de expressão de hGH foram estatisticamente diferentes somente entre os grupos gDNA/cDNA+3', sendo que o primeiro apresentou o maior nível de expressão. Quanto aos níveis de mIGF-1, não houve diferença estatística entre os grupos gDNA/cDNA+3', apenas esses dois em comparação com o cDNA e, mais uma vez, o grupo gDNA apresentando o maior nível de expressão. Foi realizado um segundo bioensaio, agora de 30 dias, no qual, além dos níveis de hGH e mIGF-1, também foram determinados os incrementos do peso corporal e do comprimento do corpo total, da cauda e dos fêmures. Ao final deste bioensaio, os níveis de expressão de hGH não apresentaram diferença estatística entre os grupos de DNA. Por outro lado, os maiores níveis de expressão de mIGF-1 foram obtidos nos grupos gDNA e cDNA+3'. Finalmente, as porcentagens de catch-up growth foram calculadas e os melhores resultados foram novamente para o gDNA, com variações de 16,6 a 32,4 % para os parâmetros avaliados. Esses resultados indicam, portanto, que o plasmídeo contendo a sequência gDNA é mais eficiente para o estímulo de expressão do IGF-1 e incremento na porcentagem de recuperação dos parâmetros analisados do que as outras sequências de DNA utilizadas. Em conclusão, os resultados alcançados neste projeto são opostos aos esperados por nós, pois acreditávamos que o cDNA poderia apresentar um maior nível de expressão quando comparado ao gDNA, em nosso modelo de terapia gênica. Pelo contrário, o gDNA apresentou os melhores resultados para hGH, mIGF-1 e catch-up growth, seguidos pelos grupos cDNA+3' e cDNA. O fato do cDNA+3' ter apresentado melhores resultados que o cDNA provavelmente é devido à região 3', a qual é conhecida por conter sequências que podem aumentar a eficiência da transcrição. Portanto, continuaremos a utilizar o vetor contendo o gDNA em nossos estudos de terapia gênica.

    Palavras-Chave: sth; hormones; gene therapy; stem cells; bone cells; dna; genome mutations; biological functions; molecular structure; electrical properties; in vitro; skeletal diseases; in vivo; rats; rodents

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  • IPEN-DOC 28450

    GOMES, ALISSANDRA de M. ; JESUS, GUSTAVO P.P. de ; ZACARIAS, ENIO A. ; YOSIDAKI, VANESSA L. ; LIMA, DARLE B. de ; COSTA, RAFAEL S. ; RANGEL, ERIKA B.; SOUSA, POLIANA E.S.; SILVA, CHRISTIAN S.; BARTOLINI, PAOLO ; PERONI, CIBELE N. . A comparison between two populations of mesenchymal stem cells that can improve the osteogenesis imperfecta mouse phenotype. In: CONGRESS OF THE BRAZILIAN SOCIETY FOR CELL BIOLOGY, 20th, January 27-29, 2021, Online. Abstract... São Paulo, SP: Sociedade Brasileira de Biologia Celular, 2021. p. 249-250.

    Abstract: Osteogenesis imperfecta (OI) is an inherited disease characterized by fragility, deformity and low bone density, besides other clinical manifestations. Type-I OI is the mildest and most common form of the disease, caused by a mutation in the COL1A1 gene and resulting in half normal-collagen production. Our purpose was to compare mesenchymal stem cells from bone marrow (BM-MSCs) with those from adipose tissue (AD-MSCs), both used for improving heterozygous oim mice phenotype, similar to human type-I OI. Mice were irradiated and cells injected into femoral condyles, bone mineral density (BMD) and femoral length were measured by X-ray, at the beginning and end of the assay. Femurs and quadriceps allowed bone fragility evaluation by biomechanical test and collagen Col1a1 and Col1a2 quantification via ELISA. BMD showed no significant difference between the groups, while femur length variation was higher in the BM-MSCs group, compared with the control (P=0.0301). Fragility was improved with AD-MSCs when flexion extension to fracture (P=0.0028) and time to fracture (P=0.0032) were evaluated. There was no significant difference in the maximum load supported by femurs until fracture. An increase in Col1a1 concentration with BM-MSCs in comparison with AD-MSCs (P=0.0281) was obtained. Although no significant difference in Col1a2 concentration was observed between the groups, a higher expression level was obtained with AD-MSCs. We can thus conclude that AD-MSCs were more efficient than BM-MSCs for improving bone quality in type-I OI.

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  • IPEN-DOC 26095

    ZACARIAS, ENIO A. ; GOMES, ALISSANDRA de M. ; JESUS, GUSTAVO P.P. de ; YOSIDAKI, VANESSA de L. ; BARTOLINI, PAOLO ; PERONI, CIBELE N. . Efficiency comparison between vectors containing the genomic or complementary DNA sequences of human growth hormone in an animal model of gene therapy. Journal of Cell Science & Therapy, v. 10, p. 34-34, 2019. DOI: 10.4172/2157-7013-C2-053

    Abstract: Our group has been working with gene therapy models for growth hormone deficiency. We are using an in vivo approach in which expression vectors containing the growth hormone (GH) gene are administered in mice, followed by electrotransference. In previous studies, elevated levels of human GH (hGH) in mice serum (~20 ng/ mL) and high growth approximation to normal mice (catch-up growth) of ~70% for body weight and of ~80% for femur length were obtained, using a plasmid containing the genomic sequence (gDNA) of GH with the ubiquitin-C promoter. On the other hand, we had an indication that the complementary sequence (cDNA) may have an advantage over gDNA in gene therapy protocols. Our objective is to carry out a comparative study between vectors containing the hGH gDNA or cDNA sequences. First, the two vectors were analyzed for in vitro expression levels by transfecting HEK-293 cells. Expression levels reached 250+50 ng hGH/mL for gDNA and 20+9.4 ng hGH/mL for cDNA transfected cells. Although in vitro expression of cDNA-containing vector was lower than that containing gDNA, we believe the cDNA vector may have better expression in vivo, due to a possible better incorporation by the muscle cells in electrotransference. Then, bioassays will be performed administering these vectors into dwarf mice, via electrotransference in the muscle. This will verify the expression profile of GH in vivo, concerning levels and durability, as well as body weight, total body, tail and femur length, mouse insulin-like growth factor-1 levels and catch-up growth.

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  • IPEN-DOC 26093

    GOMES, ALISSANDRA de M. ; JESUS, GUSTAVO P.P. de ; ZACARIAS, ENIO A. ; YOSIDAKI, VANESSA L. ; HIGUTI, ELIZA; RANGEL, ERIKA B.; BARTOLINI, PAOLO ; PERONI, CIBELE N. . Electrotransference of the mouse growth hormone gene associated with the administration of mesenchymal stem cells, in a murine model of osteogenesis imperfecta. Journal of Cell Science & Therapy, v. 10, p. 35-35, 2019. DOI: 10.4172/2157-7013-C2-053

    Abstract: Osteogenesis imperfecta (OI) is an inherited connective tissue disease characterized by fragility, deformity and low bone density, as well as by other clinical manifestations. Type I OI is the mildest and most common form of the disease, caused by mutation in the COL1A1 gene, resulting in the production of only ~50% of normal collagen. The corresponding animal model is the oim mouse, presenting a phenotype very similar to human type I OI. We aim, for the first time, at evaluating the electrotransference of mouse growth hormone (mGH) gene, encoding a protein that already showed therapeutic effects, together with the administration of murine mesenchymal stem cells (MSCs), for improving heterozygous oim mice phenotype. We already prepared and evaluated two populations of MSCs (bone marrow and adipose tissue) that emit red fluorescence. These are administrated in different amounts and via three routes (intravenously, intraperitoneally or locally into the femoral condyles) using the in vivo imaging system and histological sections of femur, liver and kidneys, a methodology we recently set up and adapted to our specific conditions. Then, we will administer the most efficient MSCs population combined with mGH gene electrotransfer. In this bioassay, we are ready to analyse different parameters: body weight, total body, tail and femur length, bone mineral density and femur fragility by a biomechanical flexion test. The results will indicate if the administration of GH by gene therapy, together with MSCs infusion, can be a promising treatment for improving type I OI phenotype.

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  • IPEN-DOC 26094

    JESUS, GUSTAVO P.P. de ; GOMES, ALISSANDRA de M. ; ZACARIAS, ENIO A. ; YOSIDAKI, VANESSA de L. ; BARTOLINI, PAOLO ; PERONI, CIBELE N. . Intramuscular growth hormone plasmid DNA eletrotransfer effects on bone quality in a murine model of osteogenesis imperfecta. Journal of Cell Science & Therapy, v. 10, p. 36-36, 2019. DOI: 10.4172/2157-7013-C2-053

    Abstract: Osteogenesis imperfecta (OI) is a congenital dysplasia of connective tissue characterized mainly by fragility and low bone density. The type I OI, a mild form of the disease, is associated with the quantitative decrease of type I collagen in the extracellular matrix, a characteristic also observed in the oim mice used in pre-clinical OI research. Previous studies have shown the efficiency of recombinant human growth hormone (GH) treatment for OI, both in animal and human models, reducing bone fragility, increasing bone density and stimulating α 1 and α 2 procollagen synthesis. This work aimed at using plasmid containing the murine GH (mGH) gene to treat oim heterozygous mice. Serological quantification of mGH by ELISA was carried out to evaluate the plasmid expression, bone density by DEXA and three-point flexion test were performed on the femurs to assess bone quality. In a short-term (3-day) trial, mGH levels of treated animals were 20.6±6.6 ng/mL, versus 3.3±2.2 ng/mL for those receiving saline and 2.3±1.3 ng/mL for the untreated wild-type group. A 90-day assay with plasmid applications at 0, 30 and 60 days was performed in parallel. The results of bone density showed greater effectiveness of the hormone during the first month of treatment, with a 34% increase in comparison with the saline group, whereas in the second month there was no significant statistical difference (p>0.05). The three-point bending test and the final analysis of bone density are currently being carried out.

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  • IPEN-DOC 27539

    LIMA, ELIANA R. ; CECCHI, CLAUDIA R. ; HIGUTI, ELIZA ; JESUS, GUSTAVO P.P. de ; GOMES, ALISSANDRA M. ; ZACARIAS, ENIO A. ; BARTOLINI, PAOLO ; PERONI, CIBELE N. . Optimization of mouse growth hormone plasmid DNA electrotransfer into tibialis cranialis muscle of "little" mice. Molecules, v. 25, n. 21, p. 1-9, 2020. DOI: 10.3390/molecules25215034

    Abstract: Previous non-viral gene therapy was directed towards two animal models of dwarfism: Immunodeficient (lit/scid) and immunocompetent (lit/lit) dwarf mice. The former, based on hGH DNA administration into muscle, performed better, while the latter, a homologous model based on mGH DNA, was less efficient, though recommended as useful for pre-clinical assays. We have now improved the growth parameters aiming at a complete recovery of the lit/lit phenotype. Electrotransfer was based on three pulses of 375 V/cm of 25 ms each, after mGH-DNA administration into two sites of each non-exposed tibialis cranialis muscle. A 36-day bioassay, performed using 60-day old lit/lit mice, provided the highest GH circulatory levels we have ever obtained for GH non-viral gene therapy: 14.7 ± 3.7 ng mGH/mL. These levels, at the end of the experiment, were 8.5 ± 2.3 ng/mL, i.e., significantly higher than those of the positive control (4.5 ± 1.5 ng/mL). The catch-up growth reached 40.9% for body weight, 38.2% for body length and 82.6%–76.9% for femur length. The catch-up in terms of the mIGF-1 levels remained low, increasing from the previous value of 5.9% to the actual 8.5%. Although a complete phenotypic recovery was not obtained, it should be possible starting with much younger animals and/or increasing the number of injection sites.

    Palavras-Chave: gene therapy; hormones; dna; muscles; mice; plasmids; bioassay

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  • IPEN-DOC 29717

    CECCHI, CLAUDIA R. ; ALSING, SIDSEL; JESUS, GUSTAVO P.P. ; ZACARIAS, ENIO A. ; KJAER, LISBETH; CLEMENT, MICHELLE S.; KUMAGAI-BRAESCH, MAKIKO; CORYDON, THOMAS J.; BARTOLINI, PAOLO ; PERONI, CIBELE N. ; AAGAARD, LARS. Sustained secretion of human growth hormone from TheraCyte devices encapsulated with PiggyBac-engineered retinal pigment epithelium cells. Tissue and Cell, v. 82, p. 1-13, 2023. DOI: 10.1016/j.tice.2023.102095

    Abstract: Growth hormone (GH) deficiency is characterized by impaired growth and development, and is currently treated by repeated administration of recombinant human GH (hGH). Encapsulated cell therapy (ECT) may offer a less demanding treatment-strategy for long-term production and release of GH into circulation. We used PiggyBac-based (PB) transposon delivery for engineering retinal pigment epithelial cells (ARPE-19), and tested a series of viral and non-viral promoters as well as codon-optimization to enhance transgene expression. Engineered cells were loaded into TheraCyte macrocapsules and secretion was followed in vitro and in vivo. The cytomegalovirus (CMV) promoter supports strong and persistent transgene expression, and we achieved clonal cell lines secreting over 6 µg hGH/106 cells/day. Codon-optimization of the hGH gene did not improve secretion. ARPE-19 cells endured encapsulation in TheraCyte devices, and resulted in steady hormone release for at least 60 days in vitro. A short-term pilot experiment in immunodeficient SCID mice demonstrated low systemic levels of hGH from a single 40 µL capsule implanted subcutaneously. No significant increase in weight increase or systemic hGH was detected after 23 days in the GH-deficient lit/SCID mouse model using 4.5 µL capsules loaded with the highest secreting clone of ARPE-19 cells. Our results demonstrate that PB-mediated engineering of ARPE-19 is an efficient way to generate hormone secreting cell lines compatible with macroencapsulation, and our CMV-driven expression cassette allows for identification of clones with high level and long-term secretory activity without addition of insulator elements. Our results pave the way for further in vivo studies of encapsulated cell therapy.

    Palavras-Chave: hormones; sth; epithelium; pigments; therapy

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O gerenciamento do Repositório está a cargo da Biblioteca do IPEN. Constam neste RI, até o presente momento 20.950 itens que tanto podem ser artigos de periódicos ou de eventos nacionais e internacionais, dissertações e teses, livros, capítulo de livros e relatórios técnicos. Para participar do RI-IPEN é necessário que pelo menos um dos autores tenha vínculo acadêmico ou funcional com o Instituto. Nesta primeira etapa de funcionamento do RI, a coleta das publicações é realizada periodicamente pela equipe da Biblioteca do IPEN, extraindo os dados das bases internacionais tais como a Web of Science, Scopus, INIS, SciElo além de verificar o Currículo Lattes. O RI-IPEN apresenta também um aspecto inovador no seu funcionamento. Por meio de metadados específicos ele está vinculado ao sistema de gerenciamento das atividades do Plano Diretor anual do IPEN (SIGEPI). Com o objetivo de fornecer dados numéricos para a elaboração dos indicadores da Produção Cientifica Institucional, disponibiliza uma tabela estatística registrando em tempo real a inserção de novos itens. Foi criado um metadado que contém um número único para cada integrante da comunidade científica do IPEN. Esse metadado se transformou em um filtro que ao ser acionado apresenta todos os trabalhos de um determinado autor independente das variáveis na forma de citação do seu nome.

A elaboração do projeto do RI do IPEN foi iniciado em novembro de 2013, colocado em operação interna em julho de 2014 e disponibilizado na Internet em junho de 2015. Utiliza o software livre Dspace, desenvolvido pelo Massachusetts Institute of Technology (MIT). Para descrição dos metadados adota o padrão Dublin Core. É compatível com o Protocolo de Arquivos Abertos (OAI) permitindo interoperabilidade com repositórios de âmbito nacional e internacional.

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