Desenvolvimento de processo de fermentacao em biorreator para producao de prolactina humana secretada no espaco periplasmico de Escherichia coli

Abstract

A Prolactina (PRL) é um dos hormônios mais versáteis em termos de ação biológica. Sua ação mais conhecida está relacionada com o estímulo da lactação e regulação do crescimento e da diferenciação da glândula mamária; também apresenta importante aplicação diagnóstica. Somando os crescentes estudos sobre suas possíveis aplicações terapêuticas, fica cada vez mais notória a necessidade da obtenção desse hormônio puro, biologicamente ativo e na sua forma autêntica.O objetivo fundamental desse projeto foi a produção de hPRL em escala laboratorial a partir de bactérias (E.coli) modificadas geneticamente, utilizando um sistema de expressão baseado no promotor Lambda () PL, o mesmo utilizado com sucesso em nosso laboratório na expressão do hGH. Descrevemos nesse trabalho um processo de cultivo em biorreator, onde não foi utilizado o repressor cIts, uma proteína termo-sensível que usualmente é utilizada para inibir o funcionamento do promotor PL durante crescimento a 30ºC. O processo de cultivo apresenta basicamente três etapas: na primeira etapa o crescimento é realizado sem adição contínua de nutrientes (cultivo em batch), na segunda etapa ocorre adição contínua de nutrientes e carboidrato (cultivo em fed-batch) e na última etapa é realizada a ativação, caracterizada pelo aumento da temperatura mantendo-se a adição de nutrientes e carboidrato. Esse processo de fermentação rápido e flexível, com duração média de 20 horas, permitiu obter uma biomassa final correspondente à densidade óptica de aproximadamente 30 A600nm (unidades ópticas de absorbância em 600nm) e com uma expressão da ordem de 1g de hPRL mL-1 A600 -1, as mais altas já relatadas para secreção de prolactina no espaço periplásmico. A hPRL monomérica foi purificada e caracterizada por métodos físico-químicos e biológicos, os quais confirmaram a sua atividade biológica e imunológica, o seu correto processamento e uma massa molecular relativa (Mr) de 22.906.