Abstract: O feijão juntamente com o arroz faz parte da alimentação básica da população brasileira, por serem ricos em proteínas, carboidratos, vitaminas, sais minerais, fibras e aminoácidos, assim podemos comparar a quantidade de proteínas que esses alimentos possuem com a carne. A produção mundial do feijão em países em desenvolvimento é de quase 50 %, sendo Myanmar, Índia e Brasil os maiores produtores. Com isso a utilização dos agrotóxicos na agricultura se torna crescente conforme se tem um aumento do consumo pela população, pois se preza a diminuição da perda devido às ações de pragas, para isso a determinação dos resíduos de agrotóxicos que os alimentos possuem e o risco que possam oferecer a saúde da população devem ser levados em conta. Portanto, o objetivo desse trabalho foi desenvolver um método analítico para caracterizar quantitativamente resíduos dos agrotóxicos fungicidas, flutriafol, procimidona, tebuconazol, presentes em alimentos vegetais com alto teor de proteínas, especificamente o feijão, utilizando a técnica analítica de cromatografia a gás acoplada a um espectrômetro de massas triplo quadrupolo, fazendo a validação com os parâmetros linearidade, sensibilidade, seletividade, precisão, exatidão, limite de quantificação e detecção. A obtenção das amostras dos feijões, Phaseolus vulgaris L, do tipo branco, preto, carioca e azuki, Vigna angularis, foram em lojas de produtos a granel e supermercados na região de São Paulo - capital. A extração foi efetuada em duas formas distintas, QuEChERS e extração sólido - líquido em baixa temperatura, utilizado o padrão de diuron para validação da extração. A metodologia foi capaz de atingir abaixo do limite máximo recomendado pelo PARA, Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos, para os compostos alvos, procimidona de 0,5 mg kg-1 e flutriafol e tebuconazol de 0,1 mg kg-1. Foram analisadas 31 amostras para cada tipo de feijão e encontrado em 7 % das amostras o fungicida procimidona acima do limite permitido.

Palavras-Chave: pesticides; trace amounts; tracer techniques; sample preparation; proteins; vegetables; beans; gas chromatography; mass spectroscopy

MIZUTANI, GUSTAVO S.Y. Análise de agrotóxicos em alimentos vegetais com alto teor de proteínas via cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas TANDEM GC - MS/MS. Orientador: Jose Oscar William Vega Bustillos. 2021. 113 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2021.tde-22102021-115140. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/32703. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Considerando os efeitos da radiação gama sobre proteínas e a capacidade do sistema imune de reconhecer macromoléculas modificadas, decidimos avaliar alguns aspectos imunológicos de camundongos B10.PL frente a ovalbumina e bothropstoxina–1 (BTHX-1), nas formas nativa e irradiada. Para avaliar prováveis modificações estruturais nas moléculas das proteínas após o processo de irradiação (radiação gama de 60Co), foi realizada a eletroforese em gel de poliacrilamida 15% para a ovalbumina e para a BTHX-1, nas formas nativa e irradiada. A ovalbumina também foi submetida à cromatografia de exclusão molecular, enquanto a BTHX-1 foi submetida à espectrometria de massa. Os resultados destes ensaios mostraram que a radiação gama foi capaz de promover alterações nas moléculas de ovalbumina e BTHX-1. A fim de avaliar a toxicidade da BTHX-1 irradiada em relação à nativa realizou-se um ensaio de citotoxicidade celular em células CHO. O resultado mostrou que a toxina na sua forma irradiada apresentou, aproximadamente, cinco vezes menos toxicidade do que a toxina na sua forma nativa. Com relação aos aspectos imunológicos, foram realizados ensaios de produção e identificação de anticorpos, nos quais, os animais foram imunizados com ovalbumina e BTHX-1, nas formas nativa ou irradiada. Observou-se que as proteínas nativas induziram, preferencialmente, uma resposta do tipo Th2, enquanto que as proteínas irradiadas induziram uma resposta do tipo Th1. Realizou-se um ensaio de proliferação celular para avaliar o comportamento de esplenócitos, retirados do baço de camundongos B10.PL, imunizados com ovalbumina e BTHX-1, nativas ou irradiadas, cultivados em presença de ambas as formas das proteínas. Em relação à ovalbumina, os resultados mostraram que tanto as células dos animais imunizados com a ovalbumina nativa como aquelas dos animais imunizados com a proteína na sua forma irradiada apresentaram crescimento semelhante. No caso da BTHX-1, os resultados mostraram que as células dos animais imunizados com a toxina irradiada foram capazes de reconhecer a forma nativa da toxina, pois apresentaram crescimento semelhante ao das células dos animais imunizados com a BTHX-1 nativa.

Palavras-Chave: proteins; antigens; ionizing radiations; immunology; venoms; detoxification

ALVES, JANAINA B. Aspectos da resposta imune frente a antigenos proteicos irradiados com sup(60)Co. Orientador: Nanci do Nascimento. 2004. 47 f. Dissertacao (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP, Sao Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2004.tde-04012005-195057. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11183. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Anexina A5 (ANXA5) é uma proteína intracelular humana de 36kDa com alta afinidade pela fosfatidilserina que é seletivamente externalizada na superfície de células apoptóticas. A apoptose apresenta um papel importante na fisiologia normal e em numerosos estados patológicos. A aplicação clínica da ANXA5 em imagem da apoptose tem sido desenvolvida em oncologia, transplante de órgãos e doenças cardiovasculares. Várias estratégias para radiomarcação da proteína têm sido descritas, incluindo marcação direta, derivatização com quelante bifuncional (BFC), produção de proteína mutante ou peptídeos análogos. Muitas técnicas de marcação com 99mTc têm sido descritas utilizando diferentes núcleos, tais como [Tc=O]+3, [99mTc]HYNIC, [TcºN]+2 e [Tc(CO3)]+1. Neste estudo, avaliamos a influência do núcleo de 99mTc no comportamento biológico e propriedades físico-químicas da anexina radiomarcada. A radiomarcação utilizando o núcleo [TcºN]+2 foi realizada em duas etapas incluindo a reação do 99mTcO4 - com SDH na presença de SnCl2 e PDTA para obter o intermediário 99mTcN-SDH, seguida da adição de ANXA5. Os resultados obtidos não estão em acordo com a literatura, apesar da alta eficiência na produção do intermediário. O núcleo [Tc=O]+3 foi produzido usando a etilenodicisteina 7 (EC) como BFC. Para derivatização empregou-se o TSTU para obter o éster succinato correspondente. Diferentes razões de ANXA5:EC foram estudadas e todas as condições de marcação resultaram em alta pureza radioquímica, porém diferenças foram observadas na lipofilicidade, estabilidade, distribuição biológica e afinidade por células apoptóticas. A ANXA5-HYNIC também produziu a proteína radiomarcada com alta pureza radioquímica. A estabilidade das ANXA5 radiomarcadas foi avaliada após incubação à temperatura ambiente, a 28°C e em incubação em soro humano a 37°C. A análise destes resultados demonstrou que a ANXA5- EC-99mTc (razão 10-2) foi o composto mais estável em todas as condições estudadas. O ensaio de coeficiente de partição demonstrou que os compostos do EC apresentam uma menor lipossolubilidade em relação a ANXA5-HYNIC-99mTc. A atividade biológica das anexinas radiomarcadas foi avaliada em células PC-3 com apoptose radioinduzida demonstrando que a ANXA5-EC-99mTc (razão 10-2) foi a proteína com maior porcentagem de ligação específica. A biodistribuição in vivo das anexinas radiomarcadas demonstrou uma alta captação na região abdominal, especialmente para a ANXA5-HYNIC-99mTc. Os resultados indicam que ANXA5-EC-99mTc (razão 10-2) pode ser uma alternativa atrativa para o uso da ANXA5-HYNIC-99mTc em imagem de receptores de fosfatidilserina.

Palavras-Chave: technetium 99; radiopharmaceuticals; labelling; computerized tomography; biological radiation effects; chemical properties; physical properties; in vitro; in vivo; proteins

SANTOS, JOSEFINA da S. Avaliacao da radiomarcacao da enexina A5 com tecnecio-99m: influencia do metodo de marcacao nas propriedades fisico-quimicas e biologicas do composto. Orientador: Elaine Bortoleti de Araujo. 2009. 146 f. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, Sao Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2009.tde-17112009-151849. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/9462. Acesso em: $DATA.

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Abstract: As raias de água doce são peixes peçonhentos que vivem no fundo dos rios, podendo esconder-se em covas rasas que são escavadas em locais arenosos ou lodosos. Estes animais não são agressivos, porém devido a estes hábitos, é grande a possibilidade de acidentes, ocorrendo quando os humanos casualmente pisam na parte dorsal destes animais, os quais utilizam a cauda para se defenderem e desferem ferroadas resultando na penetração do aguilhão no corpo da vítima. Esses acidentes ocorrem principalmente no período de estiagem na região norte do país quando os rios estão mais rasos. São descritos vários casos de acidentes por raias na literatura e os ferimentos provocados pelos ferrões destes animais são dolorosos, de difícil cicatrização, causando necroses extensas e, por vezes, fenômenos sistêmicos. Essas manifestações clínicas estão desencadeadas pela ação das proteínas bioativas presentes na peçonha e no muco. Dentre os três gêneros de raias fluviais, a Paratrygon, mesmo apresentando ampla distribuição geográfica e abundância no rio Tocantins, não tem registro de estudos bioquímicos do material secretado do ferrão do dorso do animal. O presente trabalho tem por objetivo fazer uma caracterização bioquímica de forma preliminar do muco da raia Paratrygon aiereba. Ao comparar as amostras de muco epidérmico e da peçonha da P. aiereba verificaram-se perfis proteicos muito parecidos. Através de eletroforese em gel SDS-PAGE 12% foram identificados no muco, vários componentes com massa molecular variando de 8 a 100 KDa. Através da zimografia, foram visualizadas pelo menos três proteínas com atividades gelatinolítica, e pela primeira vez, atividade caseinolítica foi observada no muco. Os dados mostram atividade importante sobre os fosfolipídios. Um peptídeo com 4.907,8 Da, elevada condutividade e discreta atividade antimicrobiana para a bactéria Gram negativa Micrococus luteus foi isolada com características similares a um peptídeo - β-defensina.Os resultados deste trabalho apontam o potencial tóxico do muco epidérmico de P. aiereba podendo agravar as lesões provocadas pela peçonha do animal.

Palavras-Chave: aquatic organisms; secretion; toxins; venoms; proteins; bacteria; fresh water; biochemistry; bioassay; biological effects; phospholipids; peptide; enzymes; antimicrobial agentes; electrophoresis; chromatography; ion exchange chromatography

AIRES, RAQUEL da S. Caracterização bioquímica preliminar de toxinas do muco de raia de água doce Paratrygon aiereba. Orientador: Delvonei Alves de Andrade. 2018. 67 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2020.tde-05022020-100006. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/30809. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A proteína jun é um dos principais integrantes do complexo AP-1 e está envolvido nos processos inflamatórios, diferenciação, apoptose e migração celular. Esta proteína pode formar homodímeros e heterodímeros por meio da dimerização que ocorre pelo sítio de sequências de leucinas. Existem evidências de que a proteína jun pode ser inibida pela proteína RPL10 mediante a ligação destas proteínas, no mesmo sítio de sequências de leucinas no núcleo celular, parando a progressão de tumores. O objetivo deste trabalho foi expressar, isolar e caracterizar a região de ligação das sequências de leucinas (região AP-1), para estudos posteriores de ligação com a proteína RPL10. O cDNA para proteína jun foi amplificado por PCR e clonado nos vetores de expressão pET 26b(+), pET 28a-c(+) e p1813 e expressa em E.coli BL21 (DE3). A proteína expressa em vetor pET28_AP1 foi eficientemente purificada pela técnica de cromatografia de afinidade a íons metálicos, por possuir uma sequência (poli)histidina que facilitou a purificação, apresentando um excelente grau de pureza. A identidade da proteína foi confirmada através de análise feita por western blotting e dot blotting e também por analise por espectrometria de massas.

Palavras-Chave: proteins; apoptosis; cloning; purification; ribosomes; tumor cells; neoplasms; mass spectroscopy

SILVA, FLAVIO S. Clonagem, expressão, purificação e caracterização estrutural da região AP-1 da oncoproteína Jun. Orientador: Regina Affonso. 2014. 54 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2014.tde-18092014-091537. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11802. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Hidrogéis são membranas formadas pela reticulação de cadeias poliméricas, empregados na área farmacêutica como produtos biomédicos. Dentre os principais polímeros selecionados para a síntese de hidrogéis, destaca-se a poliacrilamida (PAAM) devido às suas propriedades como hidrofilicidade e alto grau de intumescimento. Proteínas terapêuticas e enzimas são veiculadas em hidrogéis como carreadores de fármaco ou como dispositivos para tratamento de feridas e escaras na pele. Este trabalho teve como objetivo a síntese de uma membrana à base de PAAM favorável para veiculação de proteínas. As proteínas empregadas foram papaína e albumina de soro bovino (BSA) e as etapas do processo englobaram síntese da membrana, adição das proteínas no sistema, irradiação em condições específicas e caracterização da membrana. Ao utilizar temperaturas criogênicas na síntese e na irradiação das amostras, houve predomínio de reticulação da cadeia polimérica, fato que não ocorria em temperatura ambiente. As membranas foram obtidas com incorporação dos ativos na concentração de 0,2 a 1% (p/p), obtendo-se concentração de PAAM entre 4% a 10% (p/p), as quais receberam irradiação com raios gama provenientes de uma fonte 60Co, na dose de 25 kGy. Nas condições realizadas, as membranas não apresentaram citotoxicidade nem adesão celular, o perfil de liberação das proteínas foi adequado, a papaína manteve sua bioatividade preservada apesar do decaimento biológico e, segundo estudos de carga das moléculas, a membrana possui maior afinidade com a papaína, liberando-a mais lentamente. Desta forma, o método proposto e as membranas obtidas foram apropriados para a obtenção de um biomaterial.

Palavras-Chave: hydrogels; nanostructures; membranes; polymers; nitriles; synthesis; lyophilization; proteins; papain; albumins; cytology; adhesion; cross-linking; electrostatics; toxicity; bioassay; activity levels; gamma radiation

FERRAZ, CAROLINE C. Desenvolvimento de uma membrana nanoestruturada à base de poliacrilamida para veiculação de proteínas. Orientador: Ademar Benévolo Lugão. 2013. 101 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2013.tde-19112013-145148. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10539. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A Organização Mundial da Saúde recomenda o teste de Imunofluorescência Direta (IFD) para a realização do Diagnóstico Laboratorial e Avaliação Sorológica da raiva. Como reveladores deste teste, são utilizados conjugados fluorescentes antirribonucleoproteínas (RNPs) do vírus da raiva, produzidos a partir de anticorpos anti-RNPs obtidos da purificação de soros hiperimunes de animais imunizados com RNPs purificadas. Os objetivos deste estudo foram: avaliar os efeitos da radiação gama na imunogenicidade das RNPs e comparar dois métodos cromatográficos de purificação de imunoglobulinas anti-RNPs. Os soros de animais imunizados com RNPs irradiadas e não irradiadas foram avaliados nos testes de Imunfluorescência Indireta e Ensaio Imunoenzimático. A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que os animais imunizados com RNPs irradiadas necessitam de um menor número de doses para uma resposta imunológica com alto título de anticorpos. Por meio da IFD verificou-se que o conjugado produzido com anticorpos anti-RNPs irradiadas apresentou especificidade semelhante a do conjugado produzido a partir de anticorpos anti-RNPs não irradiadas, mas com melhor definição das inclusões características do vírus. Os processos de purificação de anticorpos por cromatografia de troca iônica e cromatografia de afinidade foram avaliados utilizando-se os testes de Bradford e eletroforese (SDS-PAGE). Pelos resultados obtidos pode-se concluir que, neste estudo, o processo de purificação que utilizou a cromatografia de afinidade foi o método que apresentou melhor rendimento, menor tempo de execução e obtenção de anticorpos com maior grau de pureza.

Palavras-Chave: gamma radiation; immunology; fluorescence; genetics; proteins; rabies; viruses; purification; antibodies; diagnosis

COSTA, ANA E.B. da. Efeitos da radiacao gama na imunogenicidade das ribonucleoproteinas (RNPs) do virus da raiva e purificacao de anticorpos anti-RNPs para diagnostico. Orientador: Patrick Jack Spencer. 2010. 68 f. Dissertacao (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, Sao Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2010.tde-02082011-141456. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/9577. Acesso em: $DATA.

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