Abstract: Culturas celulares tradicionais em monocamada nem sempre são suficientes quando aplicadas a ensaios toxicológicos pré-clínicos in vitro, pois podem frequentemente perder as características e funções quando não integradas em um tecido ou órgão. A utilização de PIONs funcionalizadas para a construção de esferoides por levitação magnética é uma ferramenta de baixo custo, de fácil manipulação e biocompatível, permitindo sua associação a linhagens celulares. Neste trabalho, as propriedades biofuncionais de esferoides celulares construídos a partir de células tumorais e nanopartículas magnéticas de óxido de ferro (PIONs) biofuncionalizadas foram estudadas, cujas nanopartículas de óxido de ferro foram sintetizadas por co-precipitação, funcionalizadas com os aminoácidos glicina e poli-L-lisina e então submetidas a caracterização físico-química por MET, DRX, DLS, potencial zeta e FTIR. A partir dessas análises foi possível identificar nanopartículas de magnetita com tamanho ideal e carga eletrostática positiva estável para adsorção às células. Essas nanopartículas também foram submetidas a uma avaliação biológica quanto a adsorção à membrana de células tumorais de próstata (LNCaP), citotoxicidade e formação de esferoides. Foi observada boa adsorção dos PIONs, sem desprendimento das células durante o cultivo celular, não foi observada citotoxicidade das nanopartículas e houve resposta magnética suficiente a fim de permitir a formação dos esferoides quando na presença de um campo magnético. Os esferoides tumorais obtidos a partir da adsorção das nanopartículas foram avaliados estruturalmente por microscopia de fluorescência e analise histológica com resultados satisfatórios para uma estrutura tumoral. Foram também utilizados como sistema-teste na avaliação do potencial tóxico de substâncias farmacológicas e não-farmacológicas de ação conhecida com resultados reprodutíveis. Portanto, o produto final deste trabalho pode ser utilizado em testes posteriores de eficácia de fármacos que visem tratar os tumores prostáticos humanos.

Palavras-Chave: neoplasms; prostate; iron oxides; nanoparticles; synthesis; glycine; glycylglycine; amino acids; spheroids; tumor cells; cell cultures; adsorption; magnetic fields; scanning electron microscopy; dynamical systems; x-ray diffraction; fourier transform spectrometers; fluorescence; microscopy; histological techniques; comparative evaluations

PASSOS, PRISCILA de Q.S. Modelo tridimensional in vitro de adenocarcinoma prostático humano produzido por levitação magnética. Orientador: Daniel Perez Vieira. 2020. 93 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2020.tde-01032021-114311. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/31927. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A pele é o maior órgão do corpo humano e constitui a principal defesa do organismo contra agentes físicos e químicos, sendo também fundamental para evitar a perda de água por dessecação. Formada por três camadas distintas, mas complementares, sendo as duas principais denominadas derme e epiderme, contendo diferentes tipos celulares, como fibroblastos, queratinócitos, melanócitos, células de Merkel e células de Langerhans, sendo que estas últimas desempenham um papel fundamental na hipersensibilidade de contato. Devido à importância da manutenção da pele saudável para a vida humana, existe uma crescente necessidade da elaboração de substitutos de tecidos para o tratamento de feridos e doentes, assim como, há grande demanda de pele para testes químicos das áreas farmacêutica e cosmética. Outro fator de fundamental importância para o desenvolvimento de métodos alternativos in vitro, é a pressão mundial para que estes testes substituam os modelos animais. Esta abordagem vai de encontro aos novos conceitos de substituição, redução e refinamento na utilização de animais em estudos científicos, ditando o futuro da cultura celular e bioengenharia de tecidos. Graças ao grande desenvolvimento do cultivo celular e descoberta de que as células cultivadas podem ser reagrupadas de acordo com o delineamento experimental, se torna possível à criação de equivalentes dermoepidérmicos para estudos in vitro, como por exemplo, testes de cito e fototoxicidade ou avaliação da fase inicial da reação alérgica e processos de sensibilização da pele. Neste caso, se faz necessária a obtenção de grande quantidade de células de Langerhans imaturas. As células de Langerhans (CLs) são células dendríticas imaturas localizadas na epiderme e epitélio superficial que desempenham um papel central na imunidade da pele, agindo como verdadeiras sentinelas capazes de captar antígenos de contato. Desta forma, foram testados quatro diferentes protocolos para extração e criopreservação destas células, sendo ainda analisadas as suas características morfológicas e fenotípicas. Obtivemos resultados não expressivos quanto ao isolamento, pureza e marcação positiva para CD1a no Protocolo 2 (Expansor de Pele). Os Protocolo 1A (Coleta de Sobrenadante) e 3 (Epiderme + Gradiente de Ficoll Paque) ofereceram altos níveis de células marcadas positivamente para CD1a, apresentando a mesma qualidade de marcação. No entanto, o Protocolo 3 forneceu um maior número de células viáveis, e uma maior pureza da amostra, uma vez que só utiliza a epiderme para a obtenção da suspensão de células, o que o coloca como modelo a ser seguido em posteriores experimentos. Os métodos aqui apontados como mais promissores, podem ser reproduzidos em laboratórios de cultura celular convencionais, contribuindo para aumentar a reprodutibilidade e confiabilidade de resultados experimentais relativos às CLs. Da mesma forma, avaliamos a utilização dos equivalentes de pele humana para a realização de testes in vitro de cito e fototoxicidade, os quais podem de fato reduzir a utilização de modelos animais para identificação do perfil tóxico de uma substância ou de formulações mais complexas.

Palavras-Chave: skin; animal cells; populations; animal tissues; three-dimensional calculations; phantoms; structural models; in vitro; rats; in vivo; cell cultures; standardization

LUCO, DAYANE P. Padronização de técnicas de isolamento de células de Langerhans imaturas e desenvolvimento de um modelo tridimensional de pele humana para testes de sensibilidade in vitro. Orientador: Monica Beatriz Mathor. 2014. 95 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2014.tde-31102014-140755. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/23179. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Grande parte das proteínas de importância biomédica são encontradas em concentrações pequenas nas suas formas nativas. Uma alternativa para obtenção de proteínas em grande escala é síntese por bactérias Escherichia coli geneticamente modificadas. Entretanto, frequentemente essas proteínas são produzidas como agregados insolúveis e inativos, denominados de corpos de inclusão (CI). Para se tornarem bioativas as proteínas nos CI devem ser renaturadas. O nosso objetivo foi o estabelecimento de um processo rápido e eficiente de obtenção da proteína de envelope (E) e do domínio III desta mesma proteína (EDIII) do vírus da ZIKA (ZIKV) solúveis e com atividade imunológica a partir de CI. A utilização destas proteínas se justifica pela sua relevância para o desenvolvimento de ensaios diagnósticos e para a produção de vacinas de ZIKV. A associação de alta pressão e pH alcalino se mostrou eficiente para a solubilização dos CI. A incubação dos CI em alta pressão (2,4 kbar por 90 min e 0,4 kbar por 14,5 h) em pH de 10,5 foi a melhor condição encontrada na qual foi obtida solubilização eficiente dos CI com baixa desnaturação proteica. O enovelamento das proteínas presentes nos sobrenadantes das suspensões submetidas à alta pressão foi obtido por diálise em tampão em pH de 8,5. A recuperação do E solúvel nesta condição foi de mais de 90% e a de EDIII foi de 80% em relação às quantidades totais dessas proteínas nos CI e os rendimentos foram de 130 mg de E e de 35 mg de EDIII/L de cultura bacteriana. As proteínas E e EDIII permaneceram imunologicamente ativas e foram recuperadas principalmente como monômeros e dímeros. O procedimento proposto representa uma alternativa para a produção de proteínas recombinantes imunologicamente ativas expressas como CI.

Palavras-Chave: zika virus; molecular biology; elementary particles; proteins; bacterial spores; cell cultures; pressure range mega pa 10-100; immunotherapy; micellar systems; biotechnology

SANTOS, DAVID P. dos. Renaturação da proteína de envelope do vírus da zika e do domínio III da mesma proteína utilizando altas pressões. Orientador: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias. 2018. 60 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2020.tde-03022020-094942. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/30804. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Hipóxia é uma condição patológica caracterizada pela redução no fornecimento de oxigênio para um determinado tecido ou célula. Em comparação com outros métodos de diagnóstico por imagem não invasivos, a Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET) é uma das modalidades mais utilizadas na detecção de hipóxia tumoral devido a sua maior especificidade e resolução espacial. Os objetivos desta tese foram sintetizar:1) sintetizar e caracterizar um radiofármaco inédito marcado com 18F, [18F]N-(4-fluorobenzil)-2-(2-nitro-1h-imidazol-1-il)acetamida [18F]FBNA, para a detecção de áreas de hipóxia no microambiente tumoral através de imagem molecular PET e; 2) comparar esse produto inédito com o radiofármaco [18F]FAZA utilizado hoje em dia em estudos clínicos para detecção de hipóxia tumoral. A molécula FBNA foi sintetizada e caracterizada química e estruturalmente por técnicas espectroscópicas. Além disso, o FBNA foi eficientemente radiomarcado com 18F ([18F]FBNA) e obtido com alta pureza química e radioquímica (> 90%), com bons tempos de radiossíntese, rendimento radioquímico e atividade molar. O novo radiofármaco [18F]FBNA mostrou-se estável em salina e em soro por até 6 horas, mais hidrofílico que o [18F]FMISO e menos hidrofílico que o [18F]FAZA. Adicionalmente, foram realizados estudos de captação celular in vitro em duas linhagens tumorais de câncer gástrico humano, demonstrando que o [18F]FBNA é captado especificamente por células em hipóxia e não em células em condições normóxicas. Com a imagem µPET, autoradiografia, e os estudos de biodistribuição ex vivo, verificou-se que o [18F]FBNA foi captado mais rápido e apresentou valores das relações Tumor/Músculo e Tumor/Sangue mais favoráveis em comparação com o [18F]FAZA, o que sugere uma eliminação mais rápida, menor captação por órgãos inespecíficos e maior qualidade de imagem do que o [18F]FAZA. O composto inédito da presente tese apresentou resultados pré-clínicos superiores ao padrão [18F]FAZA utilizado em ensaios clínicos hoje em dia, pelo que podemos concluir de nossos resultados preliminares que o radiofármaco [18F]FBNA apresenta condições favoráveis para ser o próximo radiotraçador para o diagnóstico de hipóxia na prática clínica.

Palavras-Chave: anoxia; biological stress; biochemical oxygen demand; cell cultures; tissue cultures; tumor cells; labelled compounds; radiopharmaceuticals; misonidazole; antineoplastic drugs; radiosensitizers; synthesis; clinical trials; testing; bioassay; positron computed tomography; image processing; nuclear medicine

NARIO, ARIAN P. Síntese e caracterização pré-clínica de um novo derivado de 2-nitroimidazol como potencial traçador PET para imagem de hipóxia tumoral. Orientador: Emerson Soares Bernardes. 2020. 160 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2020.tde-05112020-153215. Disponível em: http://200.136.52.105/handle/123456789/31743. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Losartan is a selective antagonist of the angiotensin II type 1 receptor (AT1R). Several reports have highlighted the AT1R expression in several cancers enhancing tumor development and cancer progression. The aim of this thesis is the synthesis and evaluation of [18F]fluoroethyl-losartan ([18F]FEtLos) and [18F]ammoniomethyltrifluoroborate-losartan ([18F]AMBF3Los) as two novel losartan analogs to image AT1R-positive tumors using the positron emission tomography (PET). Initially, the cold compounds FEtLos and AMBF3Los were synthetized by alkylation and click chemistry reactions respectively, and characterized by spectroscopic techniques. Then, radiosynthesis of 2-[18F]fluoroethyl-tosylate was optimized from a radiation safety point of view. Next, [18F]FEtLos was manually synthetized by [18F]fluoroethylation of losartan with low molar activity and greater than 99% radiochemical purity. [18F]AMBF3Los was easily synthetized with greater than 97% radiochemical purity by one step 18F-19F isotopic exchange approach using low and high activities of [18F]fluoride that afforded molar activities ranging from 2 to 139 GBq/μmol. In vitro competition binding assays showed that FEtLos and AMBF3Los have low and high binding affinity to human AT1R, respectively. AT1R expression was confirmed in breast, ovarian and gastric derived-tumors implanted on Nude mice. In spite of the low affinity, [18F]FEtLos was specific for renal AT1R. However, [18F]FEtLos did not showed specificity for tumor AT1R binding. μPET imaging, autoradiography and ex vivo biodistribution studies showed the specificity of [18F]AMBF3Los for both kidney and tumor AT1R binding. However, [18F]AMBF3Los was not able to reach the tumor site once injected intravenously probably because of its rapid metabolism and very fast clearance. Nonetheless our results demonstrate that 18F-Angiotensin II Receptor Blockers (ARBs) derivatives could be suitable tracers to cancer imaging AT1R-expressing tumor microenvironment, however, radiolabeled ARBs that possess better pharmacokinetics profile may be required.

Palavras-Chave: image processing; image scanners; positron computed tomography; neoplasms; fluorine 18; labelled compounds; blood pressure; biological markers; biological localization; animal tissues; cell cultures; in vitro; in vivo; synthesis; radiochemistry; quantitative chemical analysis; qualitative chemical analysis; statistical data

PIJEIRA, MARTHA S.O. Synthesis of fluorine-18-labeled losartan analogs as novel positron emission tomography tracers for cancer imaging. Orientador: Emerson Soares Bernardes. 2019. 144 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2019.tde-10062019-095737. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/29914. Acesso em: $DATA.

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