Abstract: Apesar dos constantes avanços no tratamento de câncer, essa doença continua sendo umas das principais causas de mortalidade no mundo todo, portanto, é imperativo que novas modalidades de tratamento sejam desenvolvidas. Venenos de serpentes causam uma variedade de efeitos biológicos, pois constituem uma mistura complexa de substâncias como disintegrinas, proteases (serino e metalo), fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases entre outras. No presente trabalho pesquisou-se em alguns venenos de serpentes frações com atividade antitumoral, pois há relatos de compostos ofídicos que apresentam esta atividade. Após fracionamento de venenos de serpentes das famílias Viperidae e Elapidae foram feitas incubações das frações obtidas com células normais de fibroblasto L929 e de melanoma B16-F10. Os resultados mostraram que as frações do veneno da serpente Notechis ater niger apresentaram a maior especificidade e potencial antitumoral em células de melanoma murino B16-F10 que os demais venenos utilizados. Este achado, aliado ao fato de ser um veneno pouco explorado foram determinantes para que este veneno fosse selecionado para dar continuidade aos estudos. As frações citotóxicas deste veneno foram submetidas a análises para identificar e caracterizar os componentes que apresentaram esta atividade atitumoral. Ensaios de western-blot e zimografia sugerem que estas proteínas não pertencem à classe das metalo e serinoproteinases.

Palavras-Chave: snakes; venoms; biological repair; proteins; tumor cells; neoplasms; bioassay; boron 16; fluorine compounds; toxicity

QUEIROZ, RODRIGO G. Componentes derivados de venenos de serpentes com ação antitumoral em células de melanoma murino. Orientador: Nanci do Nascimento. 2012. 91 f. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2012.tde-24082012-133252. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10114. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Há mais de 50 anos os geradores de 68Ge/68Ga vêm sendo desenvolvidos, obtendo o 68Ga sem a necessidade da instalação de um cíclotron próximo à radiofarmácia ou ao centro hospitalar que tenha um PET/CT. O 68Ga é um emissor de pósitron com baixa emissão de fóton (β+, 89%, 1077 keV) e meia vida de 67,7 minutos, compatível com a farmacocinética de moléculas de baixo peso molecular, como peptídeos e fragmentos de anticorpos. Além disso, a química do Ga permite a ligação estável com agentes quelantes acoplados com peptídeos, como o DOTA. Todas estas características do 68Ga aliado a tecnologia PET/CT permitiram avanços em imagem molecular, como no diagnóstico de doenças de origem neuroendócrina. Entretanto, o eluato de 68Ga proveniente dos geradores de 68Ge/68Ga comerciais, ainda contém altos níveis de contaminantes, como o 68Ge e outros metais que competem quimicamente com o 68Ga, como o Fe3+ e Zn2+ e, como consequência, há redução do rendimento de marcação com biomoléculas. Quanto menor a quantidade de impurezas no eluato, a competição entre o peptídeo radiomarcado e peptídeo não marcado será menor e a qualidade de imagem será melhor, por isso existe a necessidade de diminuir a quantidade destes metais. Portanto, os objetivos deste trabalho são avaliar os métodos de purificação do 68Ga para a marcação de biomoléculas, com ênfase no estudo das impurezas químicas presentes nos radioisótopos primários, e desenvolver um método de purificação inédito. Diversos métodos de purificação foram estudados. Na purificação em resina catiônica tradicional e comercial, em que o 68Ga é adsorvido em resina catiônica e eluído em uma solução de acetona/ácido, a resina utilizada não é disponível comercialmente. Várias resinas catiônicas foram testadas simulando o processo comercial, e o uso das menores partículas da resina catiônica AG50W-X4 (200-400 mesh) foi a que apresentou os melhores resultados. Um método inovador foi a cromatografia por extração, onde o éter diisopropílico é adsorvido em resina XAD 16 e o 68Ga eluído em água deionizada. Apesar dos resultados de recuperação do 68Ga e a separação entre o 68Ga e o 65Zn terem sido bons, não houve reprodutibilidade na purificação dos metais. O método mais promissor e inédito foi a purificação do 68Ga em resina catiônica em meio básico que apresentou bons resultados, principalmente em relação à redução do Zn (98 ± 2)%, o contaminante químico encontrado em maior abundância no eluato de 68Ga. A redução total de impurezas foi (95 ± 4)%. Os peptídeos DOTATOC/DOTATATO foram marcados com o 68Ga em três diferentes formas: purificado em meio básico, por extração por solventes e sem a purificação prévia, o melhor resultado de rendimento de marcação do 68Ga DOTATATO foi obtido após a purificação do 68Ga em meio básico, comprovando a eficiência do processo.

Palavras-Chave: purification; decontamination; gallium 67; gallium 68; resins; chromatography; radioisotope generators; isotope applications; labelling; radiopharmaceuticals; biological repair

COSTA, RENATA F. Desenvolvimento de métodos de purificação do sup(67)Ge e sup(68)Ge para a marcação de biomoléculas. Orientador: João Alberto Osso Junior. 2012. 127 f. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2012.tde-29062012-141412. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10097. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Os folatos, vitaminas hidrossolúveis do grupo B estão envolvidos em importantes processos bioquímicos como a síntese e reparação de DNA. O metabolismo humano não é capaz de sintetizar folatos e necessita obtê-los da dieta. O ácido fólico (AF), vitâmero sintético e estável dos folatos, é usado para a fortificação de alimentos como farinha de trigo em função do baixo custo e grande biodisponibilidade. O AF compreende uma pterina, um ácido p-aminobenzóico e um ácido glutâmico. É um composto sensível, facilmente degradado em solução aquosa por luz ultravioleta e visível. O tratamento por ionização de alimentos elimina ou reduz patógenos e insetos, aumenta o tempo de estocagem e a vida de prateleira dos alimentos. A irradiação de alimentos utiliza elétrons acelerados, raios gama ou raios X. Os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos dos tratamentos com feixe de elétrons, térmico em estufa e em forno micro-ondas na degradação do AF em solução, suspensão e pó. Também foi desenvolvido um método de extração por solvente pressurizado do AF de farinha de trigo fortificada e de pães. Os diferentes processamentos degradaram o AF e os principais produtos de degradação foram identificados por LC/MS/MS como sendo: 6- carboxipterina (PCA), ácido p-aminobenzóico (PABA), p-aminobenzoil-L-ácido glutâmico (pABGA) e ácido pteroico (PA). Em soluções de AF irradiadas foram identificados novos radioprodutos: n-(4-nitrobenzoil)-L-ácido glutâmico (pNBGA), xantopterina (XA) e 2-amino-6-(hidroximetil)pteridina-4(1H)-one (AHMP). Uma extração completa do AF por solvente pressurizado foi realizada com sucesso em amostras de farinha de trigo fortificada e pães em apenas 15 minutos. A panificação reduziu em até 57% o teor de AF no produto final. Por outro lado, a irradiação de farinha de trigo fortificada com doses de radiação até 10 kGy não alterou o conteúdo de AF. Esta tecnologia mostrou-se eficaz para tratamento de farinha de trigo e poderia ser utilizada como medida fitossanitária.

Palavras-Chave: folic acid; decomposition; biological repair; electron beams; heat treatments; microwave radiation; food processing; bread; flour

ARAUJO, MICHEL M. Efeito do processamento por ionização, calor e micro-ondas na degradação do ácido fólico. Orientador: Anna Lucia Casanas Haasis Villavicencio. 2012. 148 f. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2012.tde-29062012-134537. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10098. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Uma caracterização bioquímica eficiente da cicatrização das feridas por queimadura pode melhorar a rotina clínica para a ajustar os tratamento dos pacientes. Considerando a dificuldade de monitoramento de cicatrização, a espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier acoplado com o acessório de Reflexão Total Atenuada (ATR-FTIR) é uma técnica analítica a qual tem demonstrado capacidade de prover biomarcadores espectrais no materiais biológicos. Esse estudo avaliou a capacidade de usar ATR-FTIR para classificar a pele queimada com o intuito de monitorar o reparo tecidual em pacientes. Ratos Wistar com pele queimada foram avaliados pela espectroscopia ATR-FTIR nos dias 3, 7, 14 e 21 após a queimadura e comparados com amostras de grupos sadios. Os espectros obtidos foram separados nas regiões entre 900 a 1800 cm-1 e entre 2800 a 3000 cm-1 para posterior adequação quimiométrica. Avaliou-se as amplitudes das derivadas de segunda ordem dos espectros como parâmetro de discriminação, nos quais demonstraram diferenças significativas para os grupos não queimados com controle e entre grupos de queimadura usando Glicogênio (1030 cm-1), Amida I (1628 cm-1), Amida II (1514 cm-1), Colágeno em 1281 cm-1 e Colágeno em 1336 cm-1. Esses resultados indicam que ATR-FTIR é sensível para detectar os estágios de reparo tecidual e pode futuramente ser um instrumento auxiliar para a rotina clínica.

Palavras-Chave: wounds; healing; burns; skin effect; biological markers; biological repair; fourier transform spectrometers; infrared spectra; absorption spectroscopy; spectral reflectance; optical properties

CASTRO, PEDRO A.A. de. Espectroscopia de absorção no infravermelho em pele queimada: avaliação de potenciais biomarcadores para o reparo tecidual. Orientador: Denise Maria Zezell. 2018. 72 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2018.tde-03052018-110628. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/28895. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A reparação óssea é um fator crítico para o sucesso de procedimentos odontológicos e ortopédicos que necessitem do corte ósseo, sendo desejado que esta ocorra de forma rápida e eficaz. Uma maior compreensão da reparação óssea em um nível estrutural e molecular é o primeiro passo para o desenvolvimento de técnicas de corte e terapias regenerativas. Neste contexto, a técnica de FTIR possibilita obter informações sobre a estrutura e composição de tecido mineralizado. O principal objetivo deste projeto foi verificar a eficácia da espectroscopia FTIR na caracterização de diferentes estágios da reparação óssea após a realização de remoção óssea utilizando duas ferramentas de corte: o laser de Er,Cr:YSGG ou uma broca carbide multilaminada, em alta rotação. Foi realizada a remoção de dois fragmentos ósseos da mandíbula de 30 coelhos, e o processo de reparação óssea foi estudado imediatamente, 3, 7, 15, 21, e 28 dias após o procedimento cirúrgico. Utilizou-se a técnica de espectroscopia FTIR para a aquisição das imagens espectrais dos diferentes estágios de reparação, e foi analisada a proporção entre os compostos do tecido utilizando as bandas de amidas, colágeno, carbonato e fosfato dos espectros de absorção. Também foi realizada a análise histológica dos mesmos estágios de reparação estudados. A técnica de espectroscopia FTIR se mostrou eficaz na caracterização do processo de reparação óssea. Observou-se uma tendência de aumento na proporção de compostos orgânicos até o Grupo 15D, após o qual houve aumento na proporção de compostos inorgânicos indicando maior mineralização após este período. Os resultados da análise histológica mostraram diferenças nos primeiros estágios de reparação entre o corte ósseo com o laser de Er,Cr:YSGG e a broca em alta rotação. Essas diferenças não foram detectadas na espectroscopia FTIR com as técnicas de análise utilizadas. Ainda assim, os resultados obtidos mostraram que a técnica de espectroscopia FTIR foi sensível às alterações de conteúdo orgânico no processo de reparação do tecido ósseo, podendo auxiliar com o desenvolvimento de novas técnicas e ferramentas para melhorar a eficiência deste processo.

Palavras-Chave: bone tissues; biological repair; cutting; laser radiation; erbium; chromium; fourier transform spectrometers; infrared spectra; histology

BENETTI, CAROLINA. Estudo da reparação óssea por espectroscopia ATR-FTIR após remoção de fragmento da região mandibular com laser de Er, Cr:YSGG ou broca multilaminada. Orientador: Denise Maria Zezell. 2014. 88 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2014.tde-30092014-104657. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11807. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Nas últimas décadas tem aumentado o interesse pelos enxertos de pele humana radioesterilizadas, para aplicação principalmente em queimaduras extensas e profundas. Isto se deve ao fato destes enxertos apresentarem rápida aderência e menor potencial antigênico, em comparação com os demais tratamentos utilizados. A proposta deste estudo foi avaliar a histoarquitetura do enxerto de pele humana irradiada com doses de 25 kGy, 50 kGy e não irradiada, durante o processo de reparação tecidual, em camundongos Nude submetidos a enxertia de pele na região dorsal. Três grupos de animais receberam enxertos de pele humana irradiada (25 kGy e 50 kGy) e não irradiada e foram eutanasiados no 3º, 7º e 21º dia após a realização da cirurgia. Após os procedimentos histológicos de rotina, as amostras de tecido foram coradas com hematoxilina e eosina (HE) para a quantificação de queratinócitos, fibroblastos, células de defesa e vasos sanguíneos e a reação de imunofluorescência (IF) foi realizada para a determinação da expressão de colágeno do tipo I humano e do colágeno dos tipos I e III de camundongo. A quantificação, tanto das células quanto dos tipos de colágeno foi realizada por análise de imagem, utilizando o programa Image-Pro PLus 6.0. Os resultados histológicos demostraram que a pele humana irradiação, quando enxertada, influencia o aumento do número de células no local de cicatrização ao longo do tempo, principalmente na dose de 25 kGy, além de proporcionar uma melhor dispersão destas células. No 21º dia, os três grupos de animais com enxertia de pele humana tiveram parte do enxerto incorporado no processo de cicatrização. O grupo não irradiado apresentou maior incorporação do enxerto (43%), porém menor produção de colágeno do tipo III de camundongo (22%). Já os grupos com enxertia de pele irradiada apresentaram menor incorporação do enxerto (6 e 15%), mas com maior produção de colágeno do tipo III de camundongo (35% e 28%, para 25 kGy e 50 kGy, respectivamente). Com este estudo pôde-se concluir que o grupo irradiado a 25 kGy, apresenta maior proliferação celular e formação de vasos,além de melhor remodelamento da região de cicatrização.

Palavras-Chave: biological repair; grafts; in vivo; mice; cell proliferation; animal tissues; ionizing radiations; biological availability; scanning light microscopy; immunotherapy; radioimmunology; collagen; connective tissue; sterilization; biological regeneration; histology; statistical data

MIRANDA, JURANDIR T. de. Influência do enxerto de pele humana irradiada na regeneração tecidual de camundongos nude. Orientador: Monica Beatriz Mathor. 2016. 178 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2016.tde-15092016-152304. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/26827. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A deficiência de hormônio de crescimento (DGH) é tratada convencionalmente com repetidas injeções do hormônio recombinante. Este trabalho teve como objetivo estabelecer uma alternativa de tratamento baseada na transferência dos genes do hormônio de crescimento humano (hGH) ou de camundongo (mGH), em camundongos anões lit/lit ou lit/scid, mediante administração de DNA plasmidial associada à eletrotransferência, com a finalidade de atingir a máxima recuperação de crescimento em comparação ao camundongo normal (catch-up growth). Inicialmente foi realizada a administração do plasmídeo contendo o gene do mGH no músculo quadríceps exposto ou tibial anterior (TA) não exposto. Utilizando diferentes condições de eletrotransferência, baseadas em pulsos alternados de baixa (100 V/cm) e alta (1000 V/cm) voltagem (HV/LV, HV/8LV) ou em pulsos seguidos de baixa voltagem (8 pulsos de 150 V/cm), o músculo TA na condição HV/LV apresentou os maiores níveis de expressão de mGH: 6,7 ± 2,5 ng/mL. O tempo de exposição e a quantidade da enzima hialuronidase (HI) necessária para a eletrotransferência foram também analisados. O tempo de 30 minutos e a dose de 20 U de HI proporcionaram os melhores resultados de expressão. Diferentes quantidades de DNA foram também testadas, mas a administração de 50 &mu;g DNA/animal foi confirmada como a melhor. Na padronização do volume de solução do plasmídeo administrado no TA, foi observado que a injeção de 20 &mu;L de DNA apresentou expressão significativamente maior da proteína em comparação a de 10 &mu;L. Buscando uma maior expressão de GH, foi realizado experimento adicionando poli-L-glutamato ao diluente do DNA, comparando também diferentes condições de eletrotransferência (HV/LV e 375 V/cm). A condição de 375 V/cm, sem a adição do polímero, proporcionou as maiores concentrações, tanto de hGH como de mGH, no soro de camundongos lit/scid e lit/lit, respectivamente. Quando utilizados 3 pulsos de 375 V/cm e a administração do plasmídeo com o gene do mGH em dois locais de cada músculo TA, foram obtidos os mais altos níveis de expressão atingindo 14,7 ± 3,7 ng mGH/mL. Estes foram os parâmetros utilizados em um bioensaio, no qual foi também determinada a medida do comprimento inicial e final do fêmur por radiografia. Neste bioensaio de 36 dias, a curva de crescimento dos camundongos lit/lit tratados foi similar a de camundongos heterozigotos não tratados e os níveis de mGH do grupo DNA foram significativamente maiores (P<0,0002) em relação ao grupo controle. Os camundongos tratados também apresentarem concentração de mIGF-I no soro superior a do grupo controle. Considerando os parâmetros de crescimento avaliados, o grupo tratado com DNA apresentou percentuais de incremento altamente significativos em relação ao grupo controle, com P<0,001 para o peso corpóreo e P<0,002 para o comprimento do corpo, da cauda e para ambos os fêmures, com valores de catch-up da ordem de 79% para o comprimento dos fêmures. Podemos concluir que foi estabelecida uma metodologia eficiente de transferência gênica não viral, que poderá levar a uma completa normalização de crescimento de camundongos anões mediante utilização de animais mais jovens, como mencionado na literatura e em trabalho recente do nosso grupo.

Palavras-Chave: biological repair; in vivo; mice; somatostatin; hormones; gene therapy; immunotherapy; gene amplification; gene recombination; growth factors; dna repair; dna damages; electromagnetic interactions; bioassay; comparative evaluations

LIMA FILHA, ELIANA R. Otimização de parâmetros de transferência in vivo do gene do hormônio de crescimento visando a correção fenotípica de camundongos anões. Orientador: Cibele Nunes Peroni. 2016. 73 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2016.tde-29072016-145236. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/26805. Acesso em: $DATA.

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