Abstract: A prolactina humana (hPRL) é um hormônio polipeptídico secretado pela hipófise anterior sob regulação do hipotálamo, envolvido em uma variedade de processos biológicos como o desenvolvimento da glândula mamária e lactação. O produto recombinante é importante no diagnóstico médico e no tratamento de insuficiência da lactação. Este hormônio pode ocorrer sob a forma de proteína não glicosilada (NG-hPRL) e glicosilada (G-hPRL), com pesos moleculares de aproximadamente 23 e 25 kilodalton (kDa), respectivamente; possui um único sítio de N-glicosilação localizado na asparagina (Asn) posição 31, que é parcialmente ocupado, representando assim um modelo particularmente interessante de glicosilação. A atividade biológica da G-hPRL é muito menor comparada à NG-hPRL (~4 vezes) e sua função fisiológica ainda não é bem definida: a porção de carboidrato parece ter um importante papel na biossíntese, secreção, atividade biológica, e sobrevivência plasmática do hormônio. O objetivo principal desse trabalho foi comparar as estruturas dos N-glicanos presentes na prolactina glicosilada hipofisária (G-hPRL-NHPP) com a recombinante. Para obter a G-hPRL recombinante foi realizada uma produção em escala laboratorial a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO) geneticamente modificadas e adaptadas ao crescimento em suspensão. Foi adicionada, ao meio de cultura cicloheximida (CHX), cujo efeito principal foi aumentar a relação G-hPRL/NGhPRL que passou de 5% para 38%, facilitando assim a purificação da G-hPRL. A G-hPRL foi purificada em duas etapas, uma troca catiônica seguida de purificação por cromatografia liquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) que se demonstrou eficiente na separação das duas isoformas de hPRL. A G-hPRL recombinante IPEN foi assim analisada por diversas técnicas confirmando a sua pureza e atividade biológica, incluindo comparações com outras amostras de referências de origem hipofisária adquirida junto ao National Hormone & Peptide Program (NHPP-E.U.A.) . Foi realizada também a determinação inédita de Nglicanos presentes na G-hPRL produzida por células CHO e na G-hPRL nativa, produzida pela hipófise humana, possibilitando comparar as duas estruturas de carboidratos e alcançando assim uma das principais metas desse projeto. Entre as principais diferenças encontradas nas estruturas dos dois N-glicanos, destacam-se a baixa quantidade de ácido siálico (NeuAc), a alta porcentagem de glicanos sulfatos (74,0%) e com fucose (Fuc) (93,3%) presentes na amostra hipofisária e a tendência da preparação recombinante de apresentar glicanos com maior peso molecular e com uma menor variação nas isoformas.

Palavras-Chave: lth; hormones; mammary glands; lactation; recombinant dna; oligosaccharides; pituitary hormones; cho cells; high-performance liquid chromatography

CAPONE, MARCOS V.N. Caracterização da estrutura oligossacarídica de prolactina glicosilada humana (G-hPRL) nativa e recombinante. Orientador: Carlos Roberto Jorge Soares. 2013. 81 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2013.tde-04072013-161538. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10212. Acesso em: $DATA.

Esta referência é gerada automaticamente de acordo com as normas do estilo IPEN/SP (ABNT NBR 6023) e recomenda-se uma verificação final e ajustes caso necessário.

Como referenciar este item

Abstract: Uma linhagem celular de CHO, previamente modificada geneticamente pela introdução de cDNA da 2,6 sialiltransferase de rato, gerou, pela primeira vez, um hTSH recombinante com sialilação humanizada (hlsr-hTSH), mais similar ao hormônio nativo, com 61% de ligação de ácido siálico na conformação 2,3 e 39%, na conformação 2,6. O clone mais produtivo, quando submetido à amplificação gênica com 8 M de metotrexato, apresentou um nível de secreção de aproximadamente 2 g de hTSH/106 células/dia, nível este útil para a purificação e caracterização do produto. A massa molecular relativa do heterodímero e das subunidades e do hlsr-hTSH purificado, determinada por espectrometria de massa MALDI-TOF, e a hidrofobicidade relativa, determinada por RP-HPLC, não apresentaram diferenças significativas com relação às preparações de hTSH recombinante derivadas de células CHO sem a modificação devida ao gene da 2,6 sialiltransferase. Entretanto, algumas diferenças foram observadas na composição dos N-glicanos, com mais estruturas tri- e tetra-sialiladas no hlsr-hTSH. O hlsr-hTSH mostrou-se eqüipotente (p>0,05) à preparação comercial de r-hTSH (Thyrogen) e 1,5 vezes mais potente do que a preparação nativa de hTSH (p<0,001), quando analisado por um bioensaio in vivo baseado na capacidade do TSH de estimular a liberação de T4.

Palavras-Chave: rats; thyroid hormones; tsh; trh; mammals; cho cells; cell cultures; bioassay; in vivo

DAMIANI, RENATA. Expressao estavel de tireotrofina humana (r-hTSH) em celulas de mamifero (CHO) que expressam 'alfa'2,6-sialiltransferase. Orientador: Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela. 2009. 80 f. Dissertacao (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, Sao Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2009.tde-06112009-143353. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/9436. Acesso em: $DATA.

Esta referência é gerada automaticamente de acordo com as normas do estilo IPEN/SP (ABNT NBR 6023) e recomenda-se uma verificação final e ajustes caso necessário.

Como referenciar este item

Abstract: A influência do butirato de sódio (NaBu), do cloreto de manganês (MnCl2), combinados ou isolados, e da cicloheximida (CHX) na síntese de tireotrofina humana recombinante (r-hTSH) derivada de células CHO foi investigada pela primeira vez. Com exceção da CHX, que gerou uma redução de 1,5 vezes na produtividade volumétrica, todos os reagentes geraram um aumento (1,4 vezes para o MnCl2 e 3 vezes para o NaBu e NaBu+MnCl2) na produtividade volumétrica. Também foi observada uma diminuição no número de células viáveis com a utilização de todos os reagentes. A adição destes reagentes ao meio de cultura de células CHO produtoras de hTSH gerou também alterações na glicosilação do r-hTSH. As alterações geradas pela presença de CHX foram todas negativas, resultando em uma diminuição de 5,5% no conteúdo de ácido siálico, 10% na ocupação dos sítios de glicosilação, além de uma diminuição no conteúdo de todos os monossacarídeos neutros. Os demais reagentes, por outro lado, resultaram em alterações positivas. A presença de NaBu no meio de cultura acarretou um aumento de 12% no conteúdo de ácido siálico e de 3% na ocupação dos sítios de glicosilação. Com relação às estruturas de carboidratos presentes no hTSH, foi observado um aumento de 14% nas estruturas bi-antenárias, aumento no conteúdo de manose e fucose e uma diminuição no conteúdo de galactose e N-acetilglucosamina. A presença de MnCl2 no meio de cultura resultou em um aumento de 1,7% no conteúdo de ácido siálico e de 1,3% na ocupação dos sítios de glicosilação. Houve ainda um aumento no conteúdo de manose e N-acetilglucosamina e uma diminuição no conteúdo de fucose e galactose. Um aumento de 7% na freqüência de estruturas bi-antenárias foi também observado quando MnCl2 foi utilizado. O uso simultâneo de NaBu e MnCl2 proporcionou um aumento de 14% no conteúdo de ácido siálico e de 3% na ocupação dos sítios de glicosilação, bem como um aumento no conteúdo de todos os monossacarídeos neutros. Não houve, entretanto, alterações na freqüência das estruturas de carboidratos. Apesar de todas as alterações causadas pelos diferentes reagentes, não foram observadas diferenças na atividade biológica ou no comportamento farmacocinético das diferentes preparações de hTSH estudadas. Este estudo é extremamente relevante, tanto do ponto de vista do desenvolvimento de novos biofármacos, quanto do ponto de vista do controle de qualidade das glicoproteínas hormonais já utilizadas na clínica médica.

Palavras-Chave: butyric acid; sodium compounds; cycloheximide; manganese chlorides; synthesis; trh; tsh; cho cells; glycoproteins

DAMIANI, RENATA. Influência do butirato de sódio, da cicloheximida e do cloreto de manganês na produtividade, glicosilação e propriedades biológicas da tireotrofina humana derivada de CHO. Orientador: Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela. 2013. 124 f. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2014.tde-26022014-111813. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10602. Acesso em: $DATA.

Esta referência é gerada automaticamente de acordo com as normas do estilo IPEN/SP (ABNT NBR 6023) e recomenda-se uma verificação final e ajustes caso necessário.

Como referenciar este item

Abstract: Endostatina, um fragmento do colágeno XVIII de 20 kDa, é um potente inibidor de angiogênese e crescimento tumoral. Foi previamente demonstrado que a administração contínua de endostatina em modelos animais melhorou a eficácia e potência da terapia antitumoral, comparada com a administração subcutânea diária por injeções de endostatina. A liberação contínua da proteína antiangiogênica endostatina para a circulação sistêmica poderia ser um tratamento antiangiogênico ideal. O sistema Theracyte é um sistema de membranas de politetrafluoretileno semi-permeáveis para macro-encapsulamento e implante de células geneticamente modificadas para liberação de proteínas terapêuticas in vivo e que não requer a imunossupressão do hospedeiro. Com a finalidade de demonstrar a utilidade deste sistema, células CHO expressando (his)6-met-endostatina foram injetadas em dispositivos de imunoisolamento Theracyte, que foram imediatamente implantados em camundongos imunodeficientes (SCID). Em outro modelo de implante de dispositivos de imunoisolamento, os dispositivos Theracyte foram implantados em animais e depois do tempo de cicatrização (17 dias), as células expressando endostatina foram injetadas dentro dos dispositivos. Níveis altos e constantes de endostatina de até 3,7 g/ml foram detectados no plasma durante os dois meses de duração do estudo em ambos os modelos de implante dos dispositivos de imunoisolamento. Níveis mais altos de endostatina (até 6,7 g/ml) foram detectados no plasma de animais implantados com o mesmo número de células livres. Análise histológica de cortes corados por hematoxilina/eosina dos dispositivos retirados dos animais mostraram que haviam células aparentemente viáveis dentro dos dispositivos. A análise imuno-histoquímica utilizando anticorpo anti-endostatina mostrou a existência de reação nas células dentro do dispositivo e também do lado de fora, demonstrando que a endostatina, secretada pelas células recombinantes confinadas, extravasou da membrana, atingindo os tecidos ao redor.

Palavras-Chave: collagen; cho cells; tumor cells; gene recombination; immunosuppression

VALLEJO, NATALIA M. Obtenção de altos níveis séricos de endostatina murina em camundongos pela utilização de células de ovário de hamster chinês recombinantes secretando endostatina transplantadas em dispositivos de imunoisolamento. Orientador: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias. 2008. 61 f. Dissertacao (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2008.tde-09092009-185059. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11667. Acesso em: $DATA.

Esta referência é gerada automaticamente de acordo com as normas do estilo IPEN/SP (ABNT NBR 6023) e recomenda-se uma verificação final e ajustes caso necessário.

Como referenciar este item

Abstract: A prolactina é um neurohormônio que faz parte da superfamília das citocinas e está envolvida em inúmeros processos biológicos. Devido à sua ação endócrina, autócrina e parácrina, a prolactina está muitas vezes relacionada ao desenvolvimento de patogenias humanas como carcinomas e doenças autoimunes. Considerando-se que: a) diferença de 41% encontrada na sequência de aminoácidos da prolactina de camundongo em relação à humana, b) diferenças na glicosilação, fosforilação, e ligação ao receptor e, c) o fato que os modelos animais utilizados em ensaios in vivo com prolactina humana são geralmente ratos ou camundongos (modelos heterólogos), fica evidente que esses fatores podem interferir na interpretação dos resultados. Portanto, experimentos em sistemas homólogos seriam desejáveis. Esse trabalho descreve a obtenção pela primeira vez da mPRL no espaço periplásmico bacteriano, portanto na sua forma autêntica, ou seja, sem a metionina inicial, com expressão de 0,1 ± 13,2% g/mL/A600. Para isso um vetor de expressão baseado no promotor lPL foi construído e utilizado como promotor constitutivo, com ativação a 37° C. Um processo de fermentação em biorreator, com rendimentos de expressão de até 2,5 g/mL, e um processo de purificação com três etapas: concentração e purificação por hidrofobicidade (Phenyl Sepharose CL-4B) seguida por HPLC de fase reversa e HPSEC, foram também desenvolvidos. A mPRL purificada foi caracterizada por técnicas físico-químicas e biológicas em comparação com o padrão de referência da mPRL recombinante do Instituto Nacional de Saúde (NIH, EUA). A atividade biológica foi analisada e sua potência calculada foi de 33,9 ± 1,4 UI/mg. O mesmo vetor foi utilizado para a expressão do antagonista S177DmPRL, mas o baixo nível de expressão obtido inviabilizou a sua produção no espaço periplásmico de bactérias. Como alternativa, optamos por produzir essa proteína em células CHO e clones com expressão da ordem de 1 g/mL/dia foram obtidos. Com a expressão tanto da mPRL autêntica, como do S177D-mPRL, está aberto o caminho para o desenvolvimento dos estudos que envolvam modelos animais onde a mPRL e seu antagonista sejam fatores relevantes a serem considerados.

Palavras-Chave: lth; rats; synthesis; cho cells; recombinant dna; hormones; high-performance liquid chromatography

SUZUKI, MIRIAM F. Síntese e caracterização de prolactina de camundongo (mPRL) e de seu análogo (S177D-mPRL). Orientador: Carlos Roberto Jorge Borges. 2011. 98 f. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, Sao Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2011.tde-29062011-154905. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/9955. Acesso em: $DATA.

Esta referência é gerada automaticamente de acordo com as normas do estilo IPEN/SP (ABNT NBR 6023) e recomenda-se uma verificação final e ajustes caso necessário.

Como referenciar este item