Abstract: No presente trabalho estudamos a renaturação sob alta pressão hidrostática de uma forma mutante da proteína verde fluorescente (enhanced GFP, eGFP), a qual somente emite fluorescência característica quando enovelada na sua forma nativa. A abordagem do presente estudo foi focada no controle da bioatividade da proteína recombinante, a fluorescência, como alternativa à determinação de solubilidade da proteína, fator que não é um indicador ideal de enovelamento proteico adequado. A ação da alta pressão na solubilização dos corpos de inclusão (CI) de eGFP produzidos em bactérias E. coli recombinantes e no enovelamento da proteína foi estudada. A compressão dos CI de eGFP em 2,4 kbar durante 30 minutos promoveu a dissociação dos agregados. No entanto, a incubação nesta condição não favoreceu o enovelamento da eGFP. O processo de renaturação foi avaliado em diversas condições de descompressão após a dissociação em 2,4 kbar. Durante a descompressão gradual, o aumento da fluorescência foi obtido em pressões que variaram entre a pressão atmosférica e 1,38kbar. Os níveis mais elevados de fluorescência de eGFP foram obtidos por incubação durante várias horas a níveis de pressão entre 0,35 e 0,69 kbar. Esta condição de pressão se mostrou favorável à renaturação de eGFP e é possível que também possa ser utilizada para favorecer o enovelamento de outras proteínas monoméricas. Ainda utilizando a eGFP como modelo, verificamos que os CI desta proteína produzidos por bactérias cultivadas em menor temperatura (37ºC) possuem maior quantidade de proteína recombinante apresentando a fluorescência característica em 509 nm, ou seja, na sua forma nativa, do que os CI expressos em temperaturas mais elevadas (42ºC e 47ºC). A análise realizada por espectroscopia de infravermelho (FT-IR) também demonstrou que os CI produzidos em temperaturas mais brandas possuem maior grau de estruturas secundárias semelhantes às da proteína na sua forma nativa. Além disso, os CI produzidos a 37ºC também são mais facilmente solubilizados pela ação da alta pressão do que aqueles produzidos em maior temperatura. Conforme esperado, a renaturação da eGFP a partir de CI produzidos a 37ºC foi 25 vezes mais eficiente do que a obtida utilizando CI produzidos a 47ºC. No presente estudo demonstramos também que a dissociação dos agregados exercida pela ação da alta pressão (2,4 kbar) pode ser amplificada quando em associação com a incubação em baixa temperatura (-9ºC) e que a combinação destas duas propriedades físicas eleva a solubilização dos agregados em CI, com a consequente elevação dos rendimentos de renaturação de eGFP. Mostramos ainda no presente estudo que a cinética de renaturação de eGFP em 0,69 kbar é proporcional à temperatura de incubação (entre 10ºC e 50ºC). O nível mais elevado de fluorescência foi obtido quando a renaturação de eEGP foi realizada a 20ºC. A taxa de maturação do cromóforo da eGFP é mais fortemente afetada pela temperatura do que a taxa de enovelamento da proteína. Em conclusão, a temperatura de produção dos CI, a temperatura de dissociação dos agregados e a temperatura de enovelamento podem afetar muito o rendimento e a cinética da renaturação de eGFP em alta pressão. Os resultados do presente estudo podem abrir novas perspectivas para melhorias no processo de enovelamento de proteínas a partir de CI utilizando alta pressão. Também neste trabalho descrevemos a renaturação das proteínas de Xac, PilB e os produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 nunca antes obtidas na forma solúvel. Os rendimentos de solubilização destas três proteínas foram muito altos, entre 75% e 89%. A proteína PilB renaturada em alta pressão apresentou atividade ATPasica elevada, o que nunca antes foi demonstrado para a PilB de Xac.

Palavras-Chave: proteins; protein denaturation; gene recombination; pressure dependence; fluorescence; activity levels; control; escherichia coli; fourier transformation; infrared spectra; scanning electron microscopy

VALLEJO, NATALIA M. Estudos de renaturação de proteínas agregadas utilizando altas pressões hidrostáticas. Orientador: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias. 2013. 87 f. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2013.tde-31052013-100320. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10205. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A deficiência de hormônio de crescimento (DGH) é tratada convencionalmente com repetidas injeções do hormônio recombinante. Este trabalho teve como objetivo estabelecer uma alternativa de tratamento baseada na transferência dos genes do hormônio de crescimento humano (hGH) ou de camundongo (mGH), em camundongos anões lit/lit ou lit/scid, mediante administração de DNA plasmidial associada à eletrotransferência, com a finalidade de atingir a máxima recuperação de crescimento em comparação ao camundongo normal (catch-up growth). Inicialmente foi realizada a administração do plasmídeo contendo o gene do mGH no músculo quadríceps exposto ou tibial anterior (TA) não exposto. Utilizando diferentes condições de eletrotransferência, baseadas em pulsos alternados de baixa (100 V/cm) e alta (1000 V/cm) voltagem (HV/LV, HV/8LV) ou em pulsos seguidos de baixa voltagem (8 pulsos de 150 V/cm), o músculo TA na condição HV/LV apresentou os maiores níveis de expressão de mGH: 6,7 ± 2,5 ng/mL. O tempo de exposição e a quantidade da enzima hialuronidase (HI) necessária para a eletrotransferência foram também analisados. O tempo de 30 minutos e a dose de 20 U de HI proporcionaram os melhores resultados de expressão. Diferentes quantidades de DNA foram também testadas, mas a administração de 50 &mu;g DNA/animal foi confirmada como a melhor. Na padronização do volume de solução do plasmídeo administrado no TA, foi observado que a injeção de 20 &mu;L de DNA apresentou expressão significativamente maior da proteína em comparação a de 10 &mu;L. Buscando uma maior expressão de GH, foi realizado experimento adicionando poli-L-glutamato ao diluente do DNA, comparando também diferentes condições de eletrotransferência (HV/LV e 375 V/cm). A condição de 375 V/cm, sem a adição do polímero, proporcionou as maiores concentrações, tanto de hGH como de mGH, no soro de camundongos lit/scid e lit/lit, respectivamente. Quando utilizados 3 pulsos de 375 V/cm e a administração do plasmídeo com o gene do mGH em dois locais de cada músculo TA, foram obtidos os mais altos níveis de expressão atingindo 14,7 ± 3,7 ng mGH/mL. Estes foram os parâmetros utilizados em um bioensaio, no qual foi também determinada a medida do comprimento inicial e final do fêmur por radiografia. Neste bioensaio de 36 dias, a curva de crescimento dos camundongos lit/lit tratados foi similar a de camundongos heterozigotos não tratados e os níveis de mGH do grupo DNA foram significativamente maiores (P<0,0002) em relação ao grupo controle. Os camundongos tratados também apresentarem concentração de mIGF-I no soro superior a do grupo controle. Considerando os parâmetros de crescimento avaliados, o grupo tratado com DNA apresentou percentuais de incremento altamente significativos em relação ao grupo controle, com P<0,001 para o peso corpóreo e P<0,002 para o comprimento do corpo, da cauda e para ambos os fêmures, com valores de catch-up da ordem de 79% para o comprimento dos fêmures. Podemos concluir que foi estabelecida uma metodologia eficiente de transferência gênica não viral, que poderá levar a uma completa normalização de crescimento de camundongos anões mediante utilização de animais mais jovens, como mencionado na literatura e em trabalho recente do nosso grupo.

Palavras-Chave: biological repair; in vivo; mice; somatostatin; hormones; gene therapy; immunotherapy; gene amplification; gene recombination; growth factors; dna repair; dna damages; electromagnetic interactions; bioassay; comparative evaluations

LIMA FILHA, ELIANA R. Otimização de parâmetros de transferência in vivo do gene do hormônio de crescimento visando a correção fenotípica de camundongos anões. Orientador: Cibele Nunes Peroni. 2016. 73 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2016.tde-29072016-145236. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/26805. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Epitélios confluentes de queratinócitos autólogos, cultivados segundo metodologia padronizada por Rheinwald e Green em 1975, têm sido usados como enxertos em diferentes situações clínicas. Contudo, a presença de componentes xenobióticos empregados nesta metodologia implica na possibilidade de transmissão de zoonoses, príons e viroses aos pacientes, além de envolver questões éticas relacionadas à utilização de animais. Tais preocupações têm direcionado pesquisadores a buscar alternativas que superem este impasse; no entanto, as formulações obtidas até o momento não são completamente satisfatórias. Assim, nossa proposta neste estudo, foi omitir ou substituir os componentes xenobióticos tradicionalmente utilizados no meio para queratinócitos, por similares humanos. Como resultado, padronizamos um meio de cultura onde omitimos o emprego de toxina colérica, substituímos o soro fetal bovino por lisado de plaquetas humanas na concentração de 2,5% e a insulina de origem bovina foi substituída por insulina recombinante humana na mesma concentração do método original (5 &mu;g/mL). Com os resultados obtidos foi possível concluir ser viável o cultivo de queratinócitos humanos, mantidos em meio de cultura livre de componentes xenobióticos.

Palavras-Chave: tissue-equivalent materials; cell cultures; in vitro; skin; animal tissues; grafts; fibroblasts; insulin; gene recombination; irradiation procedures

ALTRAN, SILVANA C. Substituição dos componentes xenobióticos, empregados no meio de cultura para manutenção de queratinócitos humanos, por similares de origem humana. Orientador: Monica Beatriz Mathor. 2011. 89 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2011.tde-15092011-143356. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10026. Acesso em: $DATA.

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