Abstract: As atividades a serem realizadas na área do empreendimento RMB (Reator Multipropósito Brasileiro), cujas instalações e infraestrutura agregadas serão localizadas no estado de São Paulo, no município de Iperó, podem envolver a liberação de efluentes para o meio ambiente, seja de forma controlada ou não, do mesmo modo que qualquer outra instalação. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) estudados neste trabalho apresentam comportamento ubíquo, são considerados compostos químicos com alta toxicidade, persistência no meio ambiente, potencial bioacumulativo e forte tendência de se biomagnificar. O objetivo desse trabalho foi determinar 14 dos 16 HPAs majoritários, classificados pela USEPA, nas amostras de águas superficiais e subterrâneas da área de instalação do RMB e seu entorno. Foram avaliados quatro períodos distintos utilizando uma metodologia já desenvolvida e validada por Brito (2009). Foi verificado o cenário atual em relação às concentrações dos HPAs nas águas da região que será construído o empreendimento, RMB, fornecendo uma visão geral do grau de contaminação ou não dos corpos hídricos, o que contribuirá com um banco de dados para pesquisas futuras. Paralelamente, foi validado e aplicado um método analítico já existente para avaliação de HPAs nos sólidos suspensos da coluna d'água das amostras coletadas. A avaliação preliminar da área estudada demonstrou que o local do projeto RMB é preservado, mas alguns corpos d'água ao redor da área, como o rio Sorocaba, apresentam concentrações significativas de HPAs, provavelmente em razão das atividades antropogênicas no entorno, indicando que a área precisa de uma maior atenção. Utilizando a técnica analítica de HPLC com detecção UV/vis, foram quantificados compostos como Acenaftileno Fluoreno e Fenantreno acima do valor legislado nas amostras de água. Foram observadas baixas concentrações de praticamente todos os compostos estudados no material em suspensão e alguns compostos como Fluoreno, Acenafteno, Acenaftileno e Benzo[b]fluoranteno, em concentrações mais altas, é necessário um programa de monitoramento constante, para que a partir dos dados obtidos, possa-se tomar decisões concisas de controle.

Palavras-Chave: polycyclic aromatic hydrocarbons; groundwater recharge; surface waters; sample preparation; high-performance liquid chromatography; nuclear facilities; rmb reactor; comparative evaluations; environmental protection

PEREIRA, KAROLINE de P. Avaliação de HPAs nas águas subterrâneas e superficiais da área de instalação do Reator Multipropósito Brasileiro - RMB. Orientador: Marycel Elena Barboza Cotrim. 2019. 178 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2019.tde-10092019-154356. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/30175. Acesso em: $DATA.

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Abstract: O uso acentuado de fármacos e produtos de cuidado pessoal (FPCP) por grande parcela da população, associado ao aumento do número de habitantes, principalmente, em regiões costeiras, gera uma consequente e contínua entrada destas substâncias no ambiente. Com isso há uma necessidade crescente de se investigar a presença e o comportamento desta classe de contaminantes, principalmente em sedimentos, uma vez que estes são capazes de acumular e apresentar concentrações relativamente perigosas a organismos não-alvos. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o risco ambiental do fármaco fluoxetina (FLU) presente em sedimentos marinhos da região de Santos/SP, Brasil, por meio de ensaios ecotoxicológicos integrados à análises químicas para quantificação deste fármaco no ambiente marinho. Para tanto foram utilizados invertebrados marinhos, espécie Mytella charruana para a caracterização de citotoxicidade e atividade de biomarcadores, e as espécies Perna perna e Echinometra lucunter em ensaios de desenvolvimento embriolarval. Todos os orgismos-teste foram expostos à sedimentos marinhos previamente marcados com FLU. Por meio de técnicas de HPLC-ESI-MS/MS, foram identificadas e quantificadas concentrações da ordem de 10,4 ng.g-1 em sedimentos coletados no entorno do emissário submarino de esgoto de Santos (Baía de Santos, São Paulo - Brasil). A FLU apresentou efeitos sobre o desenvolvimento embriolarval de E. lucunter e P. perna e efeitos cito-genotóxicos para a espécie M. charruana, em concentrações ambientalmente relevantes. Segundo o método utilizado para avaliação de risco ambiental, a fluoxetina pode ser considerada como substância potencialmente perigosa para invertebrados aquáticos.

Palavras-Chave: industrial wastes; drugs; antidepressants; waste water; liquid wastes; waste processing; environmental impacts; risk assessment; sediments; lcpmpdpw; marine disposal; invertebrates; aquatic organisms; molluscs; sea urchins; mussels; daphnia; bacteria; toxicity; structural chemical analysis; high-performance liquid chromatography; mass spectroscopy

SANTOS, DYMES R.A. dos. Avaliação do risco ambiental da fluoxetina em sedimentos marinhos para invertebrados aquáticos. Orientador: José Roberto Rogero. 2019. 134 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2019.tde-11042019-144512. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/29886. Acesso em: $DATA.

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Abstract: O presente estudo teve como propósito o desenvolvimento de um método para a determinação e a validação de uma metodologia para a identificação e quantificação de Neonicotinóides em águas superficiais coletadas na região de Bauru, no estado de São Paulo. As técnicas analíticas estudadas para o desenvolvimento deste método foram a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas em tandem (HPLC - MS/MS), a cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (GC/MS) e a cromatografia a gás acoplada ao detector de captura de elétrons (GC/ECD). A classe de pesticidas Neonicotinóides foi escolhida para este trabalho por estar relacionada com um súbito desaparecimento de abelhas em colônias de todo o mundo. Este fenômeno é conhecido como colapso de desordem das colônias (Colony Collapse Disorder CCD) e o mesmo é caracterizado por uma rápida perda na população de abelhas adultas. Os Neonicotinóides utilizados neste estudo foram os compostos Clotianidina, Imidacloprido e Tiametoxam que foram proibidos na sua utilização como pesticidas na Europa pelo regulamento de execução nº 540/2011. As amostras foram concentradas utilizando as técnicas de extração em fase sólida (SPE) e extração líquido líquido (LLE) e injetadas no HPLC MS/MS, GC/MS e GC/ECD. As técnicas de GC/ECD e GC/MS não foram satisfatórias para a determinação na matriz água, pois, o limite de detecção (10 mg L-1), esta acima do valor máximo permitido na legislação da agência de proteção ambiental americana (0,6 μg L-1). A técnica de HPLC MS/MS utilizando o modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM) provou se adequada para este estudo por obter limites de quantificação entre 5,89 a 8,06 μg L-1 e uma linearidade entre 0,9963 e 0,9993 para os três compostos.

Palavras-Chave: insecticides; nicotine; acetylcholine; biological effects; toxicity; bees; surface waters; site characterization; chemical properties; high-performance liquid chromatography; mass spectroscopy; ion-molecule collisions; quantitative chemical analysis

AMARAL, PRISCILA O. Caracterização química dos neonicotinóides em águas superficiais via cromatografia liquída de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas em tandem (HPLC-MS/MS). Orientador: José Oscar Willian Vega Bustillos. 2017. 126 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2017.tde-17042017-150800. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/27879. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Os IFN-&alpha;2 são atualmente utilizados em terapia de hepatite B e C, leucemia, mieloma múltiplo, leucemia de células pilosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, linfoma folicular e carcinoma de células renais, em associação ou não com outras drogas. Este trabalho descreve um processo de produção, purificação e caracterização de interferon-&alpha;2a secretado para o espaço periplasmico de E. coli utilizando um vetor baseado no uso constitutivo do promotor lambda PL. Foi validada também uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) para monitoração do processo. Dessa forma, este trabalho descreve inicialmente um método de RP-HPLC para análise qualitativa e quantitativa de interferon-&alpha;2a e interferon-&alpha;2b. O método foi desenvolvido e validado quanto à recuperação, precisão, linearidade, sensibilidade e especificidade. O teste de recuperação indicou erro menor que 1 % e as determinações quantitativas intra-dia e inter-dia apresentaram desvio padrão relativo sempre menores que 4 %, enquanto a sensibilidade experimental foi de 0,3 &mu;g (RSD = 5 %). Em relação à linearidade, o coeficiente de correlação assumiu o valor de 0,998 (p<0,0001), para o intervalo de massa analisada de 0,62 a 10 &mu;g de interferon. Essa metodologia permite a aplicação de RP-HPLC como uma ferramenta poderosa para monitoração de níveis de expressão e qualidade do interferon-&alpha;2 durante ou logo após a fermentação. A temperatura ótima de expressão foi avaliada nos intervalos de 30 a 42 °C, em cultivo em erlenmeyer. As produções volumétrica e específica foram maiores para temperaturas iguais ou superiores a 35 °C. Dessa forma, considerando a potencial degradação da proteína recombinante induzida pela temperatura, a temperatura ótima para a expressão de interferon neste processo foi definida como 35 °C. Os maiores valores de produção específica e volumétrica obtidos, em produção em erlenmeyer, foram 1,04 &mu;g/mL/A600 e 3,45 mg/L, respectivamente. Foi padronizado um método de purificação laboratorial, em duas etapas: uma cromatografia de troca iônica, seguida de uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. A pureza final e a recuperação em massa foram de, respectivamente, 95,3 % e 66 %. O produto final também foi caracterizado por meio de análise em SDS-PAGE, western blotting, espectrometria de massas, HPLC de exclusão molecular e HPLC em fase reversa.

Palavras-Chave: interferon; proteins; bacteria; escherichia coli; recombinant dna; ion exchange chromatography; high-performance liquid chromatography; multiple production; mass spectroscopy; purification; site characterization

DIAS, PAULO V.S. Desenvolvimento de processo de produção e caracterização de interferon-α2a secretado no espaço periplásmico de Escherichia Coli. Orientador: Carlos Roberto Jorge Soares. 2017. 69 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2017.tde-04122017-150200. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/28422. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A radioimunoterapia tem se mostrado uma modalidade terapêutica promissora, especialmente para terapia de tumores hematológicos o que tem impulsionado o desenvolvimento deste tipo de radiofármaco. Existe hoje apenas um radioimunoconjugado aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA), ibritumomabe-tiuxetan-90Y (Zevalin®), e ele apresenta maior taxa de resposta global e de remissão completa quando comparados aos tratamentos convencionais. Entretanto, nenhum deles é comercialmente disponível no Brasil. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar as etapas envolvidas no processo de conjugação e radiomarcação com Lu-177 do anticorpo monoclonal anti-CD20, de forma que fosse possível consolidar nacionalmente a metodologia para desenvolvimento de outros radioimunoconjugados. Nos estudos realizados para determinar a melhor razão molar anticorpo:quelante (DOTA), a razão molar 1:50, apresentou pureza radioquímica elevada (superior a 95%, após a purificação) e imunorreatividade superior a muitos estudos publicados. Além disto, o imunoconjugado apresentou estabilidade de, no mínimo 3 meses, sob refrigeração quando conjugado por dois métodos diferentes. O estudo dos parâmetros de radiomarcação permitiu a obtenção de um radioimunoconjugado com atividade específica de 740 MBq/mg, com estabilidade suficientemente longa que permitirá seu transporte às clínicas médicas. Os perfis de biodistribuição e farmacocinético foram compatíveis com outros radioimunoconjugados encontrados na literatura. O radioimunoconjugado apresentou captação tumoral e estabilidade in vivo apreciáveis, esta última evidenciada pela baixa captação óssea. Realizaram-se estudos de liofilização da formulação aperfeiçoada do imunoconjugado que promoveram a liofilização sem dano estrutural evidenciado por eletroforese em gel de poliacrilamida com manutenção da imunorreatividade. A pureza radioquímica foi acima de 95% (após purificação) quando radiomarcado com atividade específica de 740 MBq/mg, com estabilidade relevante quando armazenado à -20 °C por até 48 horas. Foi possível não somente padronizar as metodologias de conjugação e radiomarcação de anticorpos monoclonais, mas também aprimorá-las de forma que o radioimunoconjugado produzido foi superior em muitos aspectos quando comparado com a literatura publicada. Conclui-se, portanto, que o radioimunoconjugado anti-CD20-DOTA-177Lu é uma ferramenta promissora para o tratamento de tumores linfáticos que expressam o receptor CD20.

Palavras-Chave: high-performance liquid chromatography; hodgkins disease; lymphomas; labelling; monoclonal antibodies; antibodies; radioimmunodetection; radioimmunoassay; isotope applications; radiotherapy

MASSICANO, ADRIANA V.F. Desenvolvimento farmacotécnico de um radioimunoconjugado para terapia de linfoma não-Hodgkin. Orientador: Elaine Bortoleti de Araújo. 2016. 207 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2016.tde-07032016-095834. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/26398. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Com a intenção de estabelecer métodos físico-químicos como uma alternativa ao bioensaio in vivo para determinação de atividade biológica, o conteúdo de hFSH, hTSH e hLH de diferentes preparações, nativas e recombinantes, foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) e comparado ao dado obtido pelo clássico bioensaio in vivo em camundongos ou ratos (BA). Para estes hormônios foi encontrada uma relação linear entre os dois métodos: hFSH BAUI = 0,9925 RP-HPLCUI - 1,3165, r = 0,9371, p < 0,001, n = 24; hTSH BA&mu;g = 0,9790 RP-HPLC&mu;g - 0,052, r = 0,8725 , p < 0,001, n = 14; hLH BAUI = 0,8771 RP-HPLCUI + 12,41; r = 0,9786, p < 0,01, n = 5. Para outras nove preparações de hFSH e onze preparações de hTSH foi determinada a diferença média (d) entre a bioatividade predita pela RP-HPLC através destas equações e da média das bioatividades obtidas com os dois métodos. Para o hLH não foi possível determinar esta diferença em virtude das poucas amostras disponíveis. No caso do hFSH, d ± DP = -2,11 ± 3,49 % sendo a precisão de 1,16% e no caso do hTSH, d ± DP = -2,01 ± 5,56 % com precisão de 1,68%. Amostras parcialmente alteradas apresentaram diferentes graus de atividade de hFSH, hTSH e hLH que puderam ser preditas por RP-HPLC com uma aceitável concordância com os bioensaios in vivo. Estes resultados demonstraram que o emprego de um ensaio físico-químico sem o uso de animais, tal como a RP-HPLC, é uma alternativa viável ao uso do bioensaio in vivo para a determinação da potência de hFSH e hTSH, reduzindo assim o número de animais em geral utilizados para assegurar a qualidade e eficácia de um produto farmacêutico.

Palavras-Chave: hormones; bioassay; in vivo; mice; activity levels; recombinant dna; high-performance liquid chromatography; physical chemistry; interlaboratory comparisons; quantitative chemical analysis

ALMEIDA, BEATRIZ E. de. Determinação de potência de diferentes preparações de foliculotrofina, luteotrofina e tireotrofina: comparação entre a quantificação por cromatografia líquida em fase reversa e por bioensaio in vivo. Orientador: Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela. 2013. 99 f. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2013.tde-10012014-142554. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10592. Acesso em: $DATA.

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Abstract: As cascavéis são classificadas como grupo monofilético contendo dois gêneros descritos ao grupo: Crotalus ssp. e Sistrurus ssp., os quais surgiram no México a aproximadamente 20 milhões de anos, colonizando então, praticamente todo o continente americano. Fatores como dieta, dimorfismo sexual, ontogenia, mutações e distribuição geográfica podem influenciar na composição dos venenos e consequentemente no envenenamento. O presente trabalho tem como objetivo caracterizar o perfil proteico, bem como as propriedades enzimáticas e imunológicas dos venenos de algumas espécies e subespécies de Crotalus ssp. (C. atrox, C. scutulatus scutulatus, C. viridis viridis, C. vegrandis, C. durissus cascavella, C. d. collilineatus e C. d. terrificus). Os resultados indicaram pouca variabilidade entre os perfis eletroforéticos dos venenos, contudo as diferenças foram na concentração relativa das proteínas. A análises proteômica identificou alguns componentes dos venenos e serinopeptidases, metalopeptidases e fosfolipases A2 foram as mais abundantes. Além disso, por zimografia, observou-se que todos os venenos analisados apresentaram atividade proteolítica e que os venenos norte-americanos em todos os zimogramas foram mais hidrolíticos. Em caseína, a atividade enzimática dos venenos foi menos intensa comparado aos outros substratos. Em relação às gelatinases das amostras estudadas, pôde ser observado inibição da atividade enzimática induzida por alguns componentes utilizando EDTA, principalmente nos venenos de C. atrox e C. vegrandis. Em relação à inibição das serinopeptidases, foi observado que todas as gelatinases dos venenos crotálicos apresentaram inibição total ou parcial da atividade hidrolítica. Houve variabilidade entre as hialuronidases encontradas dos venenos crotálicos, tanto em relação à massa das enzimas e intensidade da degradação, quanto em diferentes pHs. Nos ensaios enzimáticos quantitativos (azocaseinolítico fosfolipásico e peptidásico) os venenos Norte Americanos demonstraram conter mais proteases em relação aos venenos Sul Americanos. Por Western Blotting, as amostras reagiram com os anticorpos presentes nos soros anti-crotálico e anti-botrópico, apresentando reatividade antigênica cruzada entre as amostras homólogas e heterólogas. Além disso, houve imunoreatividade entre o soro anti-jararagina e alguns componentes de todos os venenos crotálicos norte-americanos.

Palavras-Chave: radioenzymatic assay; radioassay; radioimmunodetection; radioimmunoassay; peptides; proteins; enzymes; digestion; toxicity; reptiles; snakes; venoms; mass spectroscopy; high-performance liquid chromatography; comparative evaluations

PREZOTTO NETO, JOSÉ P. Estudo comparativo de venenos de serpentes do gênero Crotalus ssp.. Orientador: Patrick Jack Spencer. 2018. 111 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2019.tde-30012019-075833. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/29521. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A utilização de radiofármacos no diagnóstico de doenças do organismo humano tem aumentado de forma significativa nas últimas décadas. O crescente desenvolvimento de novos reagentes liofilizados (RL) para a preparação de radiofármacos, embora proporcionem uma maior variedade para o mercado de radiofármacos, deixa evidente uma das lacunas na pesquisa radiofarmacêutica: a identificação de produtos de degradação. No presente trabalho, foram identificados os principais produtos de degradação dos RL de ácido 2,3-Dimercaptosuccínico (DMSA) e Etilenodicisteína Dietil Éster (ECD) utilizando as técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência com Detecção por Arranjo de Diodos (HPLC-DAD) e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas de múltiplos estágios (LC-MSn). Realizou-se o estudo de degradação forçada do RL de DMSA e do RL de ECD nas condições de estresse hidrolítico, fotolítico, oxidativo e termodegradação. As análises foram realizadas em equipamento HPLC-DAD Shimadzu e espectrômetro de massas Bruker Daltonics. Todas as análises foram desenvolvidas utilizando coluna cromatográfica Shim-Pack VP-ODS (150 mm x 4,6 mm; 5 &mu;m). O DMSA apresentou tempo de retenção de 5,58 minutos e m/z 204,8. A hidrólise ácida do DMSA não apresentou produtos de degradação. O perfil de degradação do DMSA após hidrólise alcalina apresentou três picos cromatográficos com características mais apolares que o DMSA. No espectro de fragmentação do íon de m/z 204,8 (MS2) pode-se observar a presença do fragmento de m/z 172,9, correspondente ao aduto sodiado de ácido mercaptosuccínico (MSA); e o fragmento de m/z 139,0 (MS3), correspondente ao aduto sodiado do ácido fumárico. O íon estanho (Sn) apresentou-se coordenado ao DMSA em todos os produtos de degradação após hidrólise alcalina do RL de DMSA. As amostras submetidas à hidrólise neutra não apresentaram degradação. Nos estudos de fotólise do DMSA, o íon de m/z 267,1 pode ser identificado como o ácido diacetil dimercaptosuccínico (BATSA). O íon de m/z 127,1 foi associado ao ácido hidroximetil fosfônico e observado nos estudos de oxidação. A termodegradação do DMSA e do RL de DMSA, não apresentou uma relação de decaimento da concentração do DMSA em função do tempo. Quanto ao RL de ECD, foi observado o ECD protonado em 5,55 minutos (m/z 325,6). As análises por LC-MSn do ECD sob hidrólise alcalina mostraram que o pico com tempo de retenção de 1,71 minutos foi identificado como o íon protonado do EC ([M+H]+) em m/z 269,2. Os picos com tempo de retenção de 3,34 e 3,69 minutos foram identificados como o íon protonado do ECD na forma monoéster (ECDM). A degradação alcalina do RL de ECD apresentou os íons de m/z 441,9 (ECD-Sn) e m/z 737,9 ([ECD2+Sn]-C2H2-2H). ECD monoester monoácida (ECDM) de m/z 295,2; ECD oxidado de m/z 323,5; ECD oxidado com duas pontes dissulfeto de m/z 389,1 e dímero de ECD de m/z 645,9 foram observados da degradação oxidativa. Conclui-se que as análises por HPLC-DAD e LC-MSn podem ser utilizadas no estudo de estabilidade de RL, identificando suas impurezas e produtos de degradação.

Palavras-Chave: radiopharmaceuticals; thermal degradation; impurities; lyophilization; diagnosis; nuclear medicine; high-performance liquid chromatography; mass spectroscopy; succinic acid; ethylene; ethyl ether; quality control

ALMEIDA, ERIKA V. de. Estudo da degradação de reagentes liofilizados para radiodiagnóstico por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massas (MS). Orientador: Margareth Mie Nakamura Matsuda. 2015. 116 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2015.tde-16092015-151338. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/23987. Acesso em: $DATA.

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