Abstract: A tireoide é uma das principais glândulas do nosso sistema endócrino e responsável pela produção dos hormônios Triodotirosina (T3) e Tetraiodotironina (T4) que são responsáveis pelo controle metabólico basal. A tireoide pode ser acometida por neoplasias benignas e malignas que pode levar a uma produção anormal de hormônios e levando a sérios problemas de saúde. O diagnóstico de algumas destas neoplasias por citologia ainda não possuem altas taxas de sensibilidade e especificidade para os casos com padrão folicular, portanto o desenvolvimento de novos métodos que se baseiam na analise de características bioquímicas dos tecidos tireoidianos se faz necessário. O presente trabalho caracterizou tecidos tireoidianos normais e com bócio nodular por meio da espectroscopia no infravermelho. As imagens espectrais foram adquiridas com alta resolução e aliadas a um grande processamento das mesmas utilizando métodos de estatística multivariada se obteve diferenças bioquímicas dos tecidos. Nos resultados obtidos no presente trabalho, a maior diferença observada está na região da amida I que está relacionada a estrutura secundária da tiroglobulina devido ao processo de incorporação de iodo. Outras observações que foram feitas são diferenças em glicosilaçao do tipo N. A partir dos resultados obtidos nesta tese conclui-se que a técnica de imageamento por microespectroscopia no infravermelho é capaz de observar diferenças bioquímicas importantes entre tecidos tireoidianos sadios e com bócio, apresentando grande potencial para o desenvolvimento no futuro de novas metodologias, baseadas em espectroscopia vibracional.

Palavras-Chave: thyroid; animal tissues; neoplasms; hormones; diseases; goiter; diagnosis; glycoproteins; nitrogen; bioassay; biotechnology; spectroscopy; infrared spectra; image processing; multivariate analysis

PEREIRA, THIAGO M. Análise das diferenças bioquímicas nos tecidos e lesões tireoidianas por imageamento espectral no infravermelho (FTIR). Orientador: Denise Maria Zezell. 2013. 99 f. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2013.tde-09122013-141944. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10567. Acesso em: $DATA.

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Abstract: O estudo de poluentes com características orgânicas e inorgânicas nas águas subterrâneas e superficiais de uma dada região é uma ferramenta importante na avaliação da poluição. Os interferentes endócrinos são produtos químicos sintéticos ou naturais que têm a capacidade de atuar no sistema endócrino de seres humanos e animais mimetizando hormônios naturais estimulando respostas diferentes das que originalmente seriam geradas e podem produzir efeitos adversos sobre os organismos, mesmo em concentrações de μg e ng L-1. As atividades antrópicas são a principal fonte de entrada de interferentes endócrinos no meio ambiente. O objetivo desta pesquisa foi determinar 13 compostos orgânicos (dietilftalato, dibutilftalato, nonilfenol, bisfenol A, cafeína, androstano, estrona, estradiol, etinilestradiol, progesterona, coprostanol, colesterol e colestanol) que podem estar presentes nas águas subterrâneas e superficiais da área de instalação do Reator Multipropósito Brasileiro (RMB). Este é um estudo sem precedentes e de grande importância para a região avaliada, uma vez que fornecerá orientação sobre o grau de contaminação das águas locais antes do início do projeto de construção. O estudo também permitirá verificar se o projeto de construção do reator oferecerá algum prejuízo ambiental para a área em seu entorno. Para a determinação dos compostos de interesse, foi utilizado um método analítico desenvolvido e validado para determinação dos compostos de interesse em amostras de água e particulado da coluna d'água, consistindo na concentração das amostras por extração em fase sólida (SPE) e/ou extração ultrassônica, seguido de quantificação por cromatografia gasosa acoplada a detector de espectrometria de massa (GC/MS). Os resultados revelaram baixas concentrações de alguns dos compostos orgânicos estudados, derivados de atividades antrópicas nas proximidades do local. Os rios que atravessam a área do projeto de instalação apresentam a maioria dos valores abaixo de 0,05 μg L-1, normalmente em estação seca, exceto para cafeína, em outubro de 2016 (0,80±0,03 μg L-1 a jusante do empreendimento) e outubro de 2017 (0,22±0,01 μg L-1 a jusante do empreendimento) e para colesterol em outubro de 2017 a montante do empreendimento (6,6±0,3 μg L-1).

Palavras-Chave: water treatment; organic compounds; detection; biogeochemistry; sample preparation; water pollution; rmb reactor; nuclear facilities; endocrine diseases; endocrine glands; hormones; metrology; validation; sensitivity; socio-economic factors; gas chromatography; mass spectroscopy; high-performance liquid chromatography; x-ray diffraction

SILVA, LARISSA L. da. Avaliação de interferentes endócrinos e marcadores de atividade antrópica nos corpos d'água da área de instalação do Reator Multipropósito Brasileiro - RMB. Orientador: Marycel Elena Barboza Cotrim. 2018. 204 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2019.tde-15022019-143422. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/29792. Acesso em: $DATA.

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Abstract: As substâncias farmacologicamente ativas tem despertado interesse da comunidade científica nos últimos anos. Estas substâncias são usadas em medicina diagnóstica, tratamento e prevenção de doenças. Algumas destas substâncias são excretadas na forma não metabolizada e outras na forma ativa, sendo que muitas delas não são completamente removidas nas estações de tratamento de esgotos. Um desses grupos ativos de substâncias, são os estrogênios esteróides e seus conjugados, os quais tem sido identificados como grandes contribuintes para a desregulação endócrina. O presente trabalho consistiu de desenvolver um método analítico empregando extração em fase sólida (SPE), usando cartuchos Strata-X, e cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (CG/EM) para a determinação dos hormônios sexuais contidos nas águas subterrâneas da regiâo da cidade universitária de São Paulo, mais especificamente do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN). Dentre os hormônios conhecidos, foi dado destaque nesse trabalho para os estrogênios naturais estradiol, estrona e progesterona, e os estrogênios sintéticos etinilestradiol e norgestrel. A validação do método foi baseada no documento do INMETRO e da ANVISA. Os índices de recuperações estiveram entre 70-120% para todos os compostos, estando dentro da faixa recomendada pela literatura para matrizes ambientais. Os limites de detecção encontrados variaram de 0,062 a 0,498 μg:L-1, e os limites de quantificação foram de 0,942 a 1,343 μg:L-1. Todos os compostos apresentaram coeficientes de determinação superiores a 0,99.

Palavras-Chave: hormones; sex; steroids; estrogens; estradiol; progesterone; ground water; waste water; solids; extraction; gas chromatography; mass spectroscopy

GONSCHOROWSKI, GRACIELE P. da C. Caracterização química de hormônios sexuais em águas de poço da região da USP via cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas CG/EM. Orientador: José Oscar Willian Vega Bustillos. 2013. 132 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2013.tde-07082013-144018. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10516. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A deficiência de hormônio de crescimento (GHD) é geralmente tratada com injeções repetidas do hormônio recombinante. Nosso grupo tem trabalhado com uma alternativa para o tratamento padrão da GHD, utilizando um modelo de terapia gênica baseado em uma única injeção de DNA plasmidial (naked DNA) contendo a sequência genômica (gDNA) do hormônio de crescimento humano (hGH). Utilizamos uma abordagem in vivo na qual o vetor de expressão é administrado em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid), seguido por eletrotransferência. Em estudos anteriores, obtivemos níveis elevados de hGH no soro desses camundongos (~ 20 ng/mL) com uma aproximação de crescimento em relação ao camundongo normal (catch-up growth) de ~ 70% para o peso corporal e de ~ 80% para o comprimento do fêmur, utilizando um vetor plasmidial contendo o gDNA do hGH com o promotor de ubiquitina-C. Por outro lado, em trabalho anterior tivemos uma indicação de que a sequência complementar (cDNA) poderia ter uma vantagem sobre o gDNA em nosso protocolo de terapia gênica. No presente trabalho, nosso objetivo foi realizar um estudo comparativo entre vetores contendo as sequências genômica (gDNA), complementar (cDNA) ou complementar acrescida da região 3' (cDNA 3') do hGH. Primeiro, os vetores foram analisados quanto aos níveis de expressão in vitro mediante transfecção de células HEK-293. Os níveis de hGH foram mensurados por ELISA e atingiram 20,96 ± 4,28 μg/mL para gDNA, 1,59 ± 0,42 μg/mL para cDNA e 3,13 ± 0,71 μg/mL para cDNA+3', após 72 h da transfecção. Uma segunda quantificação foi realizada por RP-HPLC e o padrão de expressão foi o mesmo da quantificação por ELISA. Em seguida, foram realizados bioensaios administrando esses vetores em camundongos lit/scid, via eletrotransferência, no músculo tibial anterior. O primeiro bioensaio foi de 7 dias e, ao final do experimento, os níveis de expressão de hGH foram estatisticamente diferentes somente entre os grupos gDNA/cDNA+3', sendo que o primeiro apresentou o maior nível de expressão. Quanto aos níveis de mIGF-1, não houve diferença estatística entre os grupos gDNA/cDNA+3', apenas esses dois em comparação com o cDNA e, mais uma vez, o grupo gDNA apresentando o maior nível de expressão. Foi realizado um segundo bioensaio, agora de 30 dias, no qual, além dos níveis de hGH e mIGF-1, também foram determinados os incrementos do peso corporal e do comprimento do corpo total, da cauda e dos fêmures. Ao final deste bioensaio, os níveis de expressão de hGH não apresentaram diferença estatística entre os grupos de DNA. Por outro lado, os maiores níveis de expressão de mIGF-1 foram obtidos nos grupos gDNA e cDNA+3'. Finalmente, as porcentagens de catch-up growth foram calculadas e os melhores resultados foram novamente para o gDNA, com variações de 16,6 a 32,4 % para os parâmetros avaliados. Esses resultados indicam, portanto, que o plasmídeo contendo a sequência gDNA é mais eficiente para o estímulo de expressão do IGF-1 e incremento na porcentagem de recuperação dos parâmetros analisados do que as outras sequências de DNA utilizadas. Em conclusão, os resultados alcançados neste projeto são opostos aos esperados por nós, pois acreditávamos que o cDNA poderia apresentar um maior nível de expressão quando comparado ao gDNA, em nosso modelo de terapia gênica. Pelo contrário, o gDNA apresentou os melhores resultados para hGH, mIGF-1 e catch-up growth, seguidos pelos grupos cDNA+3' e cDNA. O fato do cDNA+3' ter apresentado melhores resultados que o cDNA provavelmente é devido à região 3', a qual é conhecida por conter sequências que podem aumentar a eficiência da transcrição. Portanto, continuaremos a utilizar o vetor contendo o gDNA em nossos estudos de terapia gênica.

Palavras-Chave: sth; hormones; gene therapy; stem cells; bone cells; dna; genome mutations; biological functions; molecular structure; electrical properties; in vitro; skeletal diseases; in vivo; rats; rodents

ZACARIAS, ENIO A. Comparação de eficiência entre vetores contendo a sequência genômica e complementar, acrescida ou não da região downstream, do hormônio de crescimento humano na terapia gênica. Orientador: Cibele Nunes Peroni. 2020. 72 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2020.tde-16072021-135829. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/32271. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A deficiência de hormônio de crescimento (DGH) é a deficiência mais comum entre os hormônios pituitários. A terapia utilizada atualmente consiste de injeções diárias de hormônio de crescimento humano recombinante (r-hGH), entretanto esta terapia apresenta alguns inconvenientes, como a necessidade de frequentes injeções de r-hGH durante um longo período de vida, dependendo da severidade da deficiência, e o alto custo do hormônio, em razão dos dispendiosos processos de purificação. Uma alternativa ao tratamento padrão seria aquele no qual fossem evitados estes tipos de inconvenientes e o processo de liberação da proteína fosse sustentável, por um longo período e promovesse níveis normais e sustentáveis do fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I), o principal mediador dos efeitos do GH. Uma alternativa é a terapia gênica in vivo, baseada na administração de DNA plasmidial em diversos órgãos/tecidos, seguida de eletroporação. É considerada uma metodologia bastante promissora e que tem sido alvo de vários estudos para diversos tipos de deficiências sistêmicas. Neste trabalho foram realizadas diversas administrações de um plasmídeo contendo o gene do hormônio de crescimento humano, nos músculos quadríceps exposto ou tibial anterior sem exposição, seguidas de eletroporação, em camundongos anões e imunodeficientes (lit/scid) com 40-80 dias de idade, na tentativa de obter uma correção fenotípica do nanismo, mediante a avaliação de parâmetros de crescimento. A administração deste plasmídeo no músculo tibial anterior, em camundongos com a idade inicial de 40 dias, foi capaz de proporcionar uma normalização dos níveis de mIGF-I, quando comparados aos dos camundongos não-deficientes de GH. Além disso, foram obtidos valores de catch-up dos parâmetros de crescimento longitudinal de 36-77%. Visando uma maior eficiência na expressão de GH, foram construídos plasmídeos parentais, e a partir destes, foram produzidos minicírculos de DNA com os promotores do CMV e Ubiquitina C e com os cDNAs de hGH e mGH. Estes minicírculos de DNA foram transfectados em células HEK 293 e foram até 2 vezes mais eficientes em relação aos plasmídeos convencionais com o promotor do CMV. Estes dados são bastantes promissores e abrem caminho para ensaios mais eficientes, utilizando este tipo de protocolo de terapia gênica para a DGH, visando uma normalização de todos os parâmetros de crescimento.

Palavras-Chave: biotechnology; biological regeneration; genetics; biological repair; dna repair; plasmids; hormones; endocrine glands; pituitary gland; animal growth; diseases; immunotherapy; electric fields; transformers; animal cells; cell cultures; permeability; cell membranes; cell constituents

HIGUTI, ELIZA. Correção fenotípica do nanismo avaliada por diferentes parâmetros de crescimento após administração de DNA plasmidial em modelo animal de deficiência isolada do hormônio do crescimento. Orientador: Cibele Nunes Peroni. 2016. 97 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2016.tde-07032016-091035. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/26374. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Com a intenção de estabelecer métodos físico-químicos como uma alternativa ao bioensaio in vivo para determinação de atividade biológica, o conteúdo de hFSH, hTSH e hLH de diferentes preparações, nativas e recombinantes, foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) e comparado ao dado obtido pelo clássico bioensaio in vivo em camundongos ou ratos (BA). Para estes hormônios foi encontrada uma relação linear entre os dois métodos: hFSH BAUI = 0,9925 RP-HPLCUI - 1,3165, r = 0,9371, p < 0,001, n = 24; hTSH BA&mu;g = 0,9790 RP-HPLC&mu;g - 0,052, r = 0,8725 , p < 0,001, n = 14; hLH BAUI = 0,8771 RP-HPLCUI + 12,41; r = 0,9786, p < 0,01, n = 5. Para outras nove preparações de hFSH e onze preparações de hTSH foi determinada a diferença média (d) entre a bioatividade predita pela RP-HPLC através destas equações e da média das bioatividades obtidas com os dois métodos. Para o hLH não foi possível determinar esta diferença em virtude das poucas amostras disponíveis. No caso do hFSH, d ± DP = -2,11 ± 3,49 % sendo a precisão de 1,16% e no caso do hTSH, d ± DP = -2,01 ± 5,56 % com precisão de 1,68%. Amostras parcialmente alteradas apresentaram diferentes graus de atividade de hFSH, hTSH e hLH que puderam ser preditas por RP-HPLC com uma aceitável concordância com os bioensaios in vivo. Estes resultados demonstraram que o emprego de um ensaio físico-químico sem o uso de animais, tal como a RP-HPLC, é uma alternativa viável ao uso do bioensaio in vivo para a determinação da potência de hFSH e hTSH, reduzindo assim o número de animais em geral utilizados para assegurar a qualidade e eficácia de um produto farmacêutico.

Palavras-Chave: hormones; bioassay; in vivo; mice; activity levels; recombinant dna; high-performance liquid chromatography; physical chemistry; interlaboratory comparisons; quantitative chemical analysis

ALMEIDA, BEATRIZ E. de. Determinação de potência de diferentes preparações de foliculotrofina, luteotrofina e tireotrofina: comparação entre a quantificação por cromatografia líquida em fase reversa e por bioensaio in vivo. Orientador: Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela. 2013. 99 f. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2013.tde-10012014-142554. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10592. Acesso em: $DATA.

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