Navegação Teses por assunto "protein denaturation"

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  • IPEN-DOC 19020

    VALLEJO, NATALIA M. . Estudos de renaturação de proteínas agregadas utilizando altas pressões hidrostáticas / Renaturation studies of aggregate proteins using high hydrostatic pressure . 2013. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 87 p. Orientador: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias. DOI: 10.11606/T.85.2013.tde-31052013-100320

    Abstract: No presente trabalho estudamos a renaturação sob alta pressão hidrostática de uma forma mutante da proteína verde fluorescente (enhanced GFP, eGFP), a qual somente emite fluorescência característica quando enovelada na sua forma nativa. A abordagem do presente estudo foi focada no controle da bioatividade da proteína recombinante, a fluorescência, como alternativa à determinação de solubilidade da proteína, fator que não é um indicador ideal de enovelamento proteico adequado. A ação da alta pressão na solubilização dos corpos de inclusão (CI) de eGFP produzidos em bactérias E. coli recombinantes e no enovelamento da proteína foi estudada. A compressão dos CI de eGFP em 2,4 kbar durante 30 minutos promoveu a dissociação dos agregados. No entanto, a incubação nesta condição não favoreceu o enovelamento da eGFP. O processo de renaturação foi avaliado em diversas condições de descompressão após a dissociação em 2,4 kbar. Durante a descompressão gradual, o aumento da fluorescência foi obtido em pressões que variaram entre a pressão atmosférica e 1,38kbar. Os níveis mais elevados de fluorescência de eGFP foram obtidos por incubação durante várias horas a níveis de pressão entre 0,35 e 0,69 kbar. Esta condição de pressão se mostrou favorável à renaturação de eGFP e é possível que também possa ser utilizada para favorecer o enovelamento de outras proteínas monoméricas. Ainda utilizando a eGFP como modelo, verificamos que os CI desta proteína produzidos por bactérias cultivadas em menor temperatura (37ºC) possuem maior quantidade de proteína recombinante apresentando a fluorescência característica em 509 nm, ou seja, na sua forma nativa, do que os CI expressos em temperaturas mais elevadas (42ºC e 47ºC). A análise realizada por espectroscopia de infravermelho (FT-IR) também demonstrou que os CI produzidos em temperaturas mais brandas possuem maior grau de estruturas secundárias semelhantes às da proteína na sua forma nativa. Além disso, os CI produzidos a 37ºC também são mais facilmente solubilizados pela ação da alta pressão do que aqueles produzidos em maior temperatura. Conforme esperado, a renaturação da eGFP a partir de CI produzidos a 37ºC foi 25 vezes mais eficiente do que a obtida utilizando CI produzidos a 47ºC. No presente estudo demonstramos também que a dissociação dos agregados exercida pela ação da alta pressão (2,4 kbar) pode ser amplificada quando em associação com a incubação em baixa temperatura (-9ºC) e que a combinação destas duas propriedades físicas eleva a solubilização dos agregados em CI, com a consequente elevação dos rendimentos de renaturação de eGFP. Mostramos ainda no presente estudo que a cinética de renaturação de eGFP em 0,69 kbar é proporcional à temperatura de incubação (entre 10ºC e 50ºC). O nível mais elevado de fluorescência foi obtido quando a renaturação de eEGP foi realizada a 20ºC. A taxa de maturação do cromóforo da eGFP é mais fortemente afetada pela temperatura do que a taxa de enovelamento da proteína. Em conclusão, a temperatura de produção dos CI, a temperatura de dissociação dos agregados e a temperatura de enovelamento podem afetar muito o rendimento e a cinética da renaturação de eGFP em alta pressão. Os resultados do presente estudo podem abrir novas perspectivas para melhorias no processo de enovelamento de proteínas a partir de CI utilizando alta pressão. Também neste trabalho descrevemos a renaturação das proteínas de Xac, PilB e os produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 nunca antes obtidas na forma solúvel. Os rendimentos de solubilização destas três proteínas foram muito altos, entre 75% e 89%. A proteína PilB renaturada em alta pressão apresentou atividade ATPasica elevada, o que nunca antes foi demonstrado para a PilB de Xac.

    Palavras-Chave: proteins; protein denaturation; gene recombination; pressure dependence; fluorescence; activity levels; control; escherichia coli; fourier transformation; infrared spectra; scanning electron microscopy

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O gerenciamento do Repositório está a cargo da Biblioteca do IPEN. Constam neste RI, até o presente momento 20.950 itens que tanto podem ser artigos de periódicos ou de eventos nacionais e internacionais, dissertações e teses, livros, capítulo de livros e relatórios técnicos. Para participar do RI-IPEN é necessário que pelo menos um dos autores tenha vínculo acadêmico ou funcional com o Instituto. Nesta primeira etapa de funcionamento do RI, a coleta das publicações é realizada periodicamente pela equipe da Biblioteca do IPEN, extraindo os dados das bases internacionais tais como a Web of Science, Scopus, INIS, SciElo além de verificar o Currículo Lattes. O RI-IPEN apresenta também um aspecto inovador no seu funcionamento. Por meio de metadados específicos ele está vinculado ao sistema de gerenciamento das atividades do Plano Diretor anual do IPEN (SIGEPI). Com o objetivo de fornecer dados numéricos para a elaboração dos indicadores da Produção Cientifica Institucional, disponibiliza uma tabela estatística registrando em tempo real a inserção de novos itens. Foi criado um metadado que contém um número único para cada integrante da comunidade científica do IPEN. Esse metadado se transformou em um filtro que ao ser acionado apresenta todos os trabalhos de um determinado autor independente das variáveis na forma de citação do seu nome.

A elaboração do projeto do RI do IPEN foi iniciado em novembro de 2013, colocado em operação interna em julho de 2014 e disponibilizado na Internet em junho de 2015. Utiliza o software livre Dspace, desenvolvido pelo Massachusetts Institute of Technology (MIT). Para descrição dos metadados adota o padrão Dublin Core. É compatível com o Protocolo de Arquivos Abertos (OAI) permitindo interoperabilidade com repositórios de âmbito nacional e internacional.

1. Portaria IPEN-CNEN/SP nº 387, que estabeleceu os princípios que nortearam a criação do RDI, clique aqui.


2. A experiência do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN-CNEN/SP) na criação de um Repositório Digital Institucional – RDI, clique aqui.

O Repositório Digital do IPEN é um equipamento institucional de acesso aberto, criado com o objetivo de reunir, preservar, disponibilizar e conferir maior visibilidade à Produção Científica publicada pelo Instituto, desde sua criação em 1956.

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