Navegação Teses por assunto "protein engineering"

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  • IPEN-DOC 28472

    SILVA, LUIZ F.T. da . Avaliação da capacidade angiogênica da linhagem celular de adenocarcinoma renal humano knockout para a proteína NF-kB1 / Evaluation of angiogenic capacity of human adenocarcinoma cell line knockout for NF-kB1 protein . 2021. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 68 p. Orientador: Maria Helena Bellini Marumo. DOI: 10.11606/D.85.2021.tde-22102021-122216

    Abstract: O carcinoma de células renais (CCR) é o câncer epitelial renal adulto mais comum, sendo responsável por mais de 90% de todas as neoplasias renais. O subtipo mais frequente de CCR é o de células claras (CCRcc). A maioria dos pacientes com CCRcc possui mutação no gene supressor tumoral de Von Hippel-Lindau (VHL). O gene VHL codifica uma proteína, a VHL, que é capaz de regular negativamente uma série de proteínas intracelulares, dentre elas o fator induzível por hipóxia (HIF). Muitas moléculas têm sido apontadas como responsáveis pelo fenótipo agressivo desse tumor, uma delas é o fator de transcrição NF-kB, que é o nome coletivo para os fatores de transcrição da família Rel. Em mamíferos são conhecidos cinco membros desta família: RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-kB1 (p105/p50) e o NF-kB2 (p100/p52). No CCR, o aumento da atividade do NF-kB correlacionava-se com o aumento de marcadores de angiogênese tais como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e Interleucina 6 (IL-6). Nos últimos anos vários grupos têm demonstrado o papel funcional do NF-kB1 na tumorigenicidade do CCR. Nesse projeto utilizamos a técnica CRISPR/Cas-9 para obtenção de uma linhagem celular de adenocarcinoma renal humano knockout para a proteína NF-kB1. Foi realizada a verificação do gene endógeno mais estável para condições de normóxia e hipóxia. Foi feita a quantificação dos níveis de VEGF e IL-6 em condição de normóxia e hipóxia. A técnica CRISPR/Cas9 foi eficaz para obtenção de células 786-0 nocaute para NF-kB1 (p105/p50). Dentre os oito genes endógenos analisados, o TRFC foi o mais estável e, consequentemente, o mais adequado para estudos com as células 786-0 em hipóxia. A supressão da expressão da p50 nos clones 786-0 sg1, 786-0 sg2 e 786-0 sg3 resultou na redução de VEGF e IL6 tanto em normóxia quando em hipóxia. A redução do diferencial hipóxia/normóxia demonstra uma alteração na responsividade celular à hipóxia no que diz respeito à Il-6. A redução dos níveis de IL-6, pode justificar a redução da MMP-9 e migração celular observados por nosso grupo.

    Palavras-Chave: neoplasms; carcinomas; kidneys; anoxia; animal cells; lymphokines; protein engineering; angiogenesis; comparative evaluations

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  • IPEN-DOC 26642

    TURIBIO, THOMPSON de O. . Caracterização biológica do muco epidérmico da arraia de água doce Paratrygon aiereba / Biological characterization of the epidermic mucus of freshwater stringray Paratrygon aiereba . 2018. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 83 p. Orientador: Delvonei Alves de Andrade. DOI: 10.11606/T.85.2020.tde-04022020-161042

    Abstract: A epidemiologia dos agravos por peixes peçonhentos é pouco relatada, apesar da elevada morbidade e relevância para a saúde. Na região central do Brasil, as bacias do Tocantins e do rio Araguaia são muito utilizadas para atividades recreativas, especialmente entre junho e agosto. Apesar da dificuldade da identificação do animal causador do acidente por parte do acidentado, a maioria dos trabalhos cita que o gênero Potamotrygon é o mais relacionado a estes agravos. Por outro lado, arraias do gênero Paratrygon embora apresentem um ferrão menor que arraias de outros gêneros, causam bastante acidentes por se camuflarem com facilidade devido a sua cor clara, se confundindo com o fundo dos rios e lagos. O objetivo foi identificar atividades biológicas do muco da arraia Paratrygon aiereba. Os desenhos experimentais utilizando a secreção epidérmica foram a atividade edemaciante, por meio de Pletismografia, a dinâmica da alteração no sistema microcirculatório usando a microscopia intravital, a atividade nociceptiva através de estímulos químicos, o dano celular e atividade necrosante. Analisando o comportamento da atividade edemaciante em relação ao tempo, nota-se que o efeito do edema é mais acentuado nas primeiras horas do acidente, entretanto averígua-se que após 4h do acidente esta ação tende a diminuir. O modelo proposto aponta que o tempo é um fator determinante na formação do edema (p<0.0001), posto isso, realizou-se um teste para verificar se entre os tempos estudados havia diferença significativa, sendo que há uma forte significância (p<0.0001), entre os volumes das patas que receberam o muco e as patas que receberam PBS Com relação a atividade nociceptiva pode-se notar que as concentrações testes apresentaram diferença significativa em relação ao controle PBS (p<0,05). Foi verificado que a atividade nociceptiva não apresentou uma relação dose dependente direta, posto que as maiores médias foram detectadas nas menores concentrações. Com relação a dinâmica do rolamento de leucócito, verificou-se que ao final dos 30 minutos do experimento, notou-se que na concentração de 25 μg de muco, houve um aumento de aproximadamente 4 vezes em relação ao tempo basal. Nos tempos (10, 20 e 30 minutos), ao comparar a quantidaade de 12,5 μg com as concentrações de 100 μg e 200μg, apresentaram diferenças estatísticas (p<0,0001), sendo o efeito da concentração foi considerado extremamente significante. Foram determinados os níveis de lesão celular com liberação de conteúdo citoplasmático, sendo que há uma significância extremamente forte (p< 0,0001) entre os tratamentos. Foi verificado que o muco de arraia Paratrygon aiereba não causou atividade necrosante no modelo e na concentração utilizada neste trabalho. Por fim, conclui-se que o muco da arraia Paratrygon aiereba pode causar atividade edemaciante, atividade nociceptiva, interação leucócito-endotélio e danos celulares. Entretanto, não foi verificado atividade necrosante, com o modelo experimental adotado, causado pelo muco da arraia Paratrygon aiereba.

    Palavras-Chave: aquatic organisms; secretion; toxins; venoms; fresh water; bioassay; biochemistry; biological effects; blood circulation; blood vessels; microstructure; protein engineering; necrosis; edema; leukocytes; animal cells; damage; nervous system; sense organs; mice; light transmission; optical systems; electron microscopy; image processing

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  • IPEN-DOC 25947

    CONTATORI, CAROLINA G. de S. . Efeitos do laser de baixa potência de emissão infravermelha (λ=780nm) em células de melanoma murino e humano / Effects of near infrared laser (λ = 780nm) on murine and human melanoma cells . 2019. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 74 p. Orientador: Martha Simões Ribeiro. DOI: 10.11606/D.85.2019.tde-30072019-132516

    Abstract: O câncer de pele pode ser do tipo melanoma ou não melanoma, sendo comum em pessoas acima de 40 anos, de pele clara ou com doenças cutâneas prévias. A incidência do melanoma é baixa, porém, é considerado o mais agressivo e mortal devido ao seu alto poder metastático. A cirurgia ainda é a forma de tratamento mais empregada para a doença, sendo muito invasiva e, portanto, terapias coadjuvantes estão sendo empregadas a fim de melhorar a qualidade de vida dos pacientes, como o laser de baixa potência (LBP). Sabe-se que o LBP pode desencadear efeito bioestimulatório em culturas celulares crescidas sob déficit nutricional, porém em linhagens tumorais sua ação é controversa. Dessa forma, o objetivo desse estudo consiste em investigar os efeitos inibitórios do LBP no comportamento de células de melanoma murino B16F10 e humano SKMEL 37 utilizando um laser de emissão infravermelha (λ = 780 nm) com diferentes densidades de energia. Foram adotados 4 grupos experimentais: G0 (grupo controle), G30 (30 J.cm-2), G90 (90 J.cm-2) e G150 (150 J.cm-2) a fim de verificar a viabilidade celular, através do ensaio de MTT e vermelho neutro; o comportamento de invasão celular, obtido através do ensaio de invasão transwell; e o papel do LBP na expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), verificado através do ensaio imunoenzimático ELISA. Os resultados mostraram que a densidade de energia de 30 J.cm-2 estimulou o comportamento de invasão da linhagem celular B16F10. Por outro lado, o LBP não exerceu influência na expressão do fator de crescimento endotelial vascular, na viabilidade celular, e na atividade mitocondrial de ambas as linhagens celulares, em nenhuma das densidades de energia utilizadas, em comparação ao controle.

    Palavras-Chave: neoplasms; melanomas; animal cells; reticuloendothelial system; protein engineering; blood vessels; mitochondria; cardiovascular system; skin diseases; infrared radiation; lasers; low level counting; biological effects

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  • IPEN-DOC 22025

    SANTANA, PATRICIA M. . Expressão de tireotrofina humana em células de embrião de rim humano (HEK293) / Human tryrotropin expression in human embrionic kidney cells (HEK293) . 2016. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 64 p. Orientador: Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela. DOI: 10.11606/D.85.2016.tde-05122016-160030

    Abstract: Neste trabalho foi transfectada uma linhagem de células embrionárias de rim humano (HEK293) com os genes das subunidades &alpha; e &beta; da tireotrofina humana (hTSH), hormônio glicoproteico secretado pela hipófise. Após 5 dias de cultivo obteve-se uma concentração de hTSH no meio condicionado de 0,95&mu;g/mL. O material foi concentrado e purificado utilizando uma estratégia envolvendo duas etapas, uma cromatografia de troca catiônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa, que permitiu uma recuperação de 55% e uma pureza >90%. O produto purificado (hTSH-HEK) foi analisado e comparado a uma preparação comercial obtida em células CHO (hTSH-CHO) e a uma preparação hipofisária (hTSH-Pit). A identidade e a pureza do hTSH-HEK foram avaliadas por métodos físicoquímicos e imunológico (espectrometria de massa MALDI-TOF, HPLC de exclusão molecular e de fase reversa, SDS-PAGE e ensaio imunoradiométrico). A porção glicídica do hTSH-HEK foi avaliada pela análise do perfil dos N-glicanos e o comportamento biológico deste hormônio foi avaliado por bioensaio in vivo e estudo farmacocinético. As 3 preparações apresentaram pureza equivalente (97%) e a massa molecular relativa do hTSH-HEK foi 2,1% menor do que a do hTSH-CHO e 2,7% maior do que a do hTSH-Pit. A maior hidrofobicidade relativa, avaliada por RP-HPLC, foi a do hTSH-HEK. Os N-glicanos identificados no hTSH-HEK foram do tipo complexo, apresentando predominantemente estruturas tri-antenárias, enquanto no hTSH-CHO e no hTSH-Pit as estruturas bi-antenárias foram predominantes. Foram detectadas diferenças significativas relacionadas à composição dos carboidratos para estas preparações, um teor muito menor de ácido siálico e muito maior de fucose foram observados no hTSHHEK. Foi confirmada a atividade biológica das 3 preparações, sendo a bioatividade do hTSHHEK 39% e 16% inferior à do hTSH-CHO e hTSH-Pit, respectivamente. A meia-vida circulatória do hTSH-HEK foi menor (1,5 X) que a do hTSH-CHO e a do hTSH-Pit (1,2 X). De acordo com esses resultados o hTSH-HEK pode ser considerado uma alternativa viável para aplicações clínicas especialmente por sua origem humana e composição de carboidratos.

    Palavras-Chave: animal cells; kidneys; embryonic cells; animal tissues; tissue cultures; recombinant dna; trh; thyroid; liberins; peptide hormones; protein engineering; glycoproteins; pituitary gland; carbohydrates; bioassay; labelled compounds; cations; chromatography; high-performance liquid chromatography; gamma spectrometers; beta spectrometers; spectrometers; pulse analyzers; nuclear engineering

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  • IPEN-DOC 26103

    AMARAL, KLEICY C. . Expressão, purificação e caracterização físico-química da rhBMP-2 (recombinante humana BMP-2) / Expression, purification and physical-chemical characterization of rhBMP-2 . 2019. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 85 p. Orientador: Daniel Perez Vieira. DOI: 10.11606/D.85.2019.tde-17102019-105240

    Abstract: As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são um grupo proteico pertencente à superfamília dos fatores transformadores de crescimento beta (TGF-β). Dentre estas, a BMP-2 humana recombinante (rhBMP-2) tem sido amplamente estudada, devido suas propriedades osteoindutoras. Já existe a comercialização desta proteína produzida por tecnologia de DNA recombinante em células de ovário de hamster chinês (CHO) e para fins de pesquisa, a expressa no citoplasma de bactérias Escherichia coli (E. coli). A rhBMP-2 na sua forma homodimérica possui alta atividade biológica, induzindo a mineralização óssea em ossos endocondrais e a diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos e osteoclastos. O objetivo desse trabalho consistiu em obter a rhBMP-2 através da produção em bactérias E. coli, altamente purificada através de técnicas cromatográficas e com atividade biológica. As cepas utilizadas para produção foram a W3110 e a BL21(DE), transformadas com plasmídeos contendo o cDNA da hBMP-2 cultivadas em três temperaturas de expressão: 25 °C, 37 °C e 42 °C. Para purificação dessa proteína foram utilizadas duas técnicas cromatográficas: afinidade a heparina e exclusão molecular por cromatografia líquida de alto desempenho (HPSEC). As coletas destas etapas de purificação levaram a separação de oito produtos que foram caracterizados por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western Blotting (WB). A atividade biológica foi averiguada por produção de fosfatase alcalina em células mioblásticas de camundongo (C2C12). A avaliação dos produtos comerciais também foi feita através dessas técnicas. Os resultados indicaram que dois dos oito produtos purificados, um obtido a partir da produção na cepa BL21(DE) à 25 °C e outro da produção na cepa W3110 à 42 °C, apresentaram relevante grau de pureza e atividade biológica.

    Palavras-Chave: biochemistry; protein engineering; interaction cells; skeleton; molecular biology; escherichia coli; bacteria; high-performance liquid chromatography; physical chemistry; testing; performance

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  • IPEN-DOC 22017

    SILVA, NATAN V. da . Produção e estudo de atividade antiangiogênica de proteínas de fusão endostatina-domínio BH3 das proteínas pró-apoptóticas PUMA e BIM / Production and study of the antiangiogenic activity of the fusion proteins endostatin-BH3 domain of the pro-apoptotic proteins PUMA and BIM . 2015. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 38 p. Orientador: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias. DOI: 10.11606/D.85.2016.tde-23032016-155417

    Abstract: A endostatina (ES) é uma proteína inibidora da angiogênese, com ação específica sobre células endoteliais em proliferação, utilizada para tratamento de tumores sólidos. No entanto, o elevado efeito antitumoral da ES observado em animais não é reproduzido em humanos. Com o intuito de potencializar a eficácia terapêutica da ES, produzimos duas proteínas híbridas com dois domínios funcionais. O primeiro domínio é a ES, que apresenta especificidade por células endoteliais ativadas, dirigindo estas proteínas de fusão às células endoteliais em proliferação, promovendo sua internalização e seu efeito inibitório. Como segundo domínio funcional utilizamos os domínios BH3 próapoptóticos de duas proteínas BH3-only com o objetivo de promover a liberação de citocromo C e desencadear o processo de apoptose, aumentando a ação antiangiogênica da ES. Neste trabalho, foram desenhadas duas proteínas de fusão que contêm o domínio BH3 das potentes proteínas pró apoptóticas PUMA e BIM (ES-PUMA e ES-BIM), que deveriam apresentar efeito antiangiogênico potencializado em relação à ES selvagem. A inserção dos fragmentos de DNA codificantes para os domínios BH3 de PUMA e BIM no vetor contendo o gene da ES (pET-ES) foram realizadas por mutagênese sítiodirigida. Estas proteínas de fusão recombinantes foram expressas como corpos de inclusão em E.coli, renaturadas utilizando processo que utiliza alta pressão e purificadas em resina de afinidade por heparina. O tratamento de células endoteliais com as proteínas ES-PUMA e ES-BIM não levou à queda de viabilidade em ensaio de MTS ou de apoptose avaliado por citometria de fluxo, em comparação com os resultados obtidos pelo tratamento com ES.

    Palavras-Chave: angiogenesis; blood vessels; carcinogenesis; growth factors; neoplasms; tumor cells; collagen; resins; polysaccharides; protein engineering; reticuloendothelial system; counting techniques; molecular biology; biotechnology; medical examinations; medical surveillance; diagnosis

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O gerenciamento do Repositório está a cargo da Biblioteca do IPEN. Constam neste RI, até o presente momento 20.950 itens que tanto podem ser artigos de periódicos ou de eventos nacionais e internacionais, dissertações e teses, livros, capítulo de livros e relatórios técnicos. Para participar do RI-IPEN é necessário que pelo menos um dos autores tenha vínculo acadêmico ou funcional com o Instituto. Nesta primeira etapa de funcionamento do RI, a coleta das publicações é realizada periodicamente pela equipe da Biblioteca do IPEN, extraindo os dados das bases internacionais tais como a Web of Science, Scopus, INIS, SciElo além de verificar o Currículo Lattes. O RI-IPEN apresenta também um aspecto inovador no seu funcionamento. Por meio de metadados específicos ele está vinculado ao sistema de gerenciamento das atividades do Plano Diretor anual do IPEN (SIGEPI). Com o objetivo de fornecer dados numéricos para a elaboração dos indicadores da Produção Cientifica Institucional, disponibiliza uma tabela estatística registrando em tempo real a inserção de novos itens. Foi criado um metadado que contém um número único para cada integrante da comunidade científica do IPEN. Esse metadado se transformou em um filtro que ao ser acionado apresenta todos os trabalhos de um determinado autor independente das variáveis na forma de citação do seu nome.

A elaboração do projeto do RI do IPEN foi iniciado em novembro de 2013, colocado em operação interna em julho de 2014 e disponibilizado na Internet em junho de 2015. Utiliza o software livre Dspace, desenvolvido pelo Massachusetts Institute of Technology (MIT). Para descrição dos metadados adota o padrão Dublin Core. É compatível com o Protocolo de Arquivos Abertos (OAI) permitindo interoperabilidade com repositórios de âmbito nacional e internacional.

1. Portaria IPEN-CNEN/SP nº 387, que estabeleceu os princípios que nortearam a criação do RDI, clique aqui.


2. A experiência do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN-CNEN/SP) na criação de um Repositório Digital Institucional – RDI, clique aqui.

O Repositório Digital do IPEN é um equipamento institucional de acesso aberto, criado com o objetivo de reunir, preservar, disponibilizar e conferir maior visibilidade à Produção Científica publicada pelo Instituto, desde sua criação em 1956.

Operando, inicialmente como uma base de dados referencial o Repositório foi disponibilizado na atual plataforma, em junho de 2015. No Repositório está disponível o acesso ao conteúdo digital de artigos de periódicos, eventos, nacionais e internacionais, livros, capítulos, dissertações, teses e relatórios técnicos.

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