Abstract: Ensaios pré-clínicos e clínicos de terapia gênica e terapia celular vêm sendo desenvolvidos e aplicados de forma bastante promissora, ao longo das últimas décadas, frente à procura pela cura ou pela melhora efetiva de diversas desordens genéticas. Nosso grupo de Terapia Gênica do Centro de Biotecnologia, do IPEN, possui ampla experiência na entrega in vivo de DNA plasmidial contendo os genes do hormônio de crescimento humano (hGH) e murino (mGH) para o tratamento de camundongos GH-deficientes, desenvolvendo protocolos que apresentaram resultados bastante relevantes nos últimos 10 anos. Diante disso, neste trabalho propomos uma abordagem inédita baseada na associação entre a terapia gênica in vivo e o transplante alogênico de células-tronco mesenquimais para o tratamento da osteogênese imperfeita (OI) em um modelo murino, o camundongo oim. A principal característica da OI é a fragilidade óssea causada, principalmente, pelas mutações nos genes que sintetizam ou processam o colágeno tipo I, e nos genes responsáveis pela maturação dos osteoblastos. Inicialmente, nós avaliamos duas linhagens de células-tronco mesenquimais (CTMs), extraídas de dois tecidos diferentes, medula óssea (CTM-MO) e tecido adiposo (CTM-TA), a fim de compreender quais das duas melhor exerce um papel osteo reparador sobre os fêmures de camundongos oim. Estas células foram aplicadas localmente através dos côndilos femorais dos camundongos oim, previamente irradiados. O bioensaio para comparação entre essas duas células apresentou resultados positivos em relação à ação das CTM-TA sobre a melhora da qualidade óssea dos fêmures destes animais, através da dosagem da cadeia αII (I) do colágeno tipo I, e sobretudo pelos resultados significativos (P < 0,05) obtidos na avaliação biomecânica. Desta forma, esta linhagem foi escolhida para o bioensaio de avaliação pré-clínica, associando o transplante alogênico destas células à eletroporação do gene do mGH. As técnicas utilizadas foram baseadas em protocolos pré-clínicos realizados por nosso grupo de terapia gênica, tanto para a melhora fenotípica de modelos GH-deficientes, quanto para a de camundongos oim heterozigotos. Os resultados revelaram que a associação entre a terapia gênica in vivo e o transplante das CTM-TA foi estatisticamente significativa (P < 0,05) em relação ao controle negativo para praticamente todos os parâmetros avaliados, mostrando que estas células possuem sua atividade reparadora, possivelmente, potencializada pela super expressão do mGH. Coletivamente, os dados encontrados neste trabalho abrem novos horizontes para o entendimento da ação das CTM-TA na reparação tecidual, assim como o papel anabolizante do GH sobre a melhora do fenótipo da OI tipo I.

Palavras-Chave: sth; hormones; gene therapy; stem cells; bone cells; fibroblasts; proteins; biological functions; molecular structure; electrical properties; magnetic fields; cobalt 60; carbon dioxide fixation; skeletal diseases; adenovirus; in vivo; rats; rodents

GOMES, ALISSANDRA de M. Eletrotransferência do gene do hormônio de crescimento de camundongo associada à administração de células-tronco mesenquimais em modelo murino de osteogênese imperfeita. Orientador: Cibele Nunes Peroni. 2021. 131 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2021.tde-14072021-145052. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/32257. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Nosso grupo tem estudado uma estratégia alternativa de tratamento para a deficiência de hormônio de crescimento (DGH), utilizando a administração in vivo do plasmídeo pUC-UBI-hGH, seguida de eletroporação, no músculo quadríceps de camundongos anões e imunodeficientes (lit/scid), que proporcionou níveis sustentáveis de hGH na circulação durante 60 dias e um aumento significativo de peso dos animais tratados. Visando investigar os efeitos autócrinos/parácrinos e endócrinos derivados deste tipo de tratamento, e compará-los aos da administração diária por via parenteral do hormônio de crescimento humano recombinante (r-hGH) neste modelo animal, os seguintes parâmetros de crescimento foram avaliados no presente trabalho: peso corpóreo, comprimento total do corpo e da cauda, pesos de órgãos (fígado, rins, coração, baço, músculos quadríceps e gastrocnêmio) e os níveis plasmáticos de mIGF-I (fator de crescimento semelhante à insulina I de camundongo) e de glicose. Em um primeiro experimento, foram observados aumentos altamente significativos (P<0,001) do peso corpóreo e do comprimento total do corpo e da cauda, após 50 dias de tratamento. Todos os órgãos analisados para o grupo tratado, exceto os músculos gastrocnêmios apresentaram aumentos de peso altamente significativos. O quadríceps direito, o que recebeu a injeção do DNA plasmidial, apresentou um aumento de peso de 48,1% em comparação com o controle injetado com salina (P<0,001), enquanto o aumento de peso dos quadríceps esquerdo, não injetados, dos animais tratados foi de 31% (P<0,005). Estes dados sugerem efeitos locais (autócrino e / ou parácrinos) e sistêmicos (endócrinos) resultantes da injeção do plasmídeo contendo o gene do hGH e da consequente expressão e secreção do hGH. Em outro experimento, a comparação da administração única de DNA plasmidial com injeções diárias de r-hGH proporcionou aumentos significativos dos pesos corpóreos, em relação ao grupo controle, de 23,1% (P<0,01) e de 35,5% (P<0,001) para os grupos tratados com DNA e proteína, respectivamente, enquanto as inclinações das curvas de crescimento foram praticamente idênticas: 0,094 g / animal / dia para a injeção de DNA e 0,095 g / animal / dia para a proteína. Entre os dois grupos tratados, não houve diferenças significativas entre o peso dos seguintes órgãos: rins direito e esquerdo, baço e músculo quadríceps direito. Os níveis de glicose no plasma dos grupos tratados e controle não apresentaram diferenças significativas ao final dos tratamentos de 28 e 50 dias. As diferenças das concentrações de mIGF-I entre os grupos tratados foram significativas apenas após 7 dias de tratamento. Os valores foram sempre maiores para o grupo tratado com DNA plasmidial em relação ao grupo do r-hGH, e os níveis de ambos os grupos tratados foram significativamente superiores ao do grupo controle. Apesar da necessidade de outros estudos para confirmar a segurança e a viabilidade deste tratamento, este tipo de terapia gênica para a DGH pode vir a ser uma alternativa viável ao tratamento padrão desta doença, baseado em repetidas injeções de r-hGH altamente purificado.

Palavras-Chave: sth; plasmids; recombinant dna; in vivo; rats; gene therapy; glucose; injection

HIGUTI, ELIZA. Estudo dos efeitos endócrinos e parácrinos do hormônio de crescimento após administração de DNA plasmidial em modelos animais de terapia gênica. Orientador: Cibele Nunes Peroni. 2011. 47 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2011.tde-05082011-105039. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/9989. Acesso em: $DATA.

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Abstract: O sistema de expressão baseado nos promotores PL ou PR do fago lambda que usualmente é regulado pelo repressor termo lábil (cIts) é amplamente utilizado para produzir proteínas recombinantes em células procarióticas. No entanto, o aumento da temperatura requerido neste sistema para promover a inativação do repressor apresenta algumas limitações, como o aumento da expressão de proteínas de HSP (Heat Shock Proteins), por exemplo, proteases, que dependendo da natureza da proteína expressa podem ser prejudiciais ou não. Uma outra limitação é a ativação da resposta SOS, resultando na parada da replicação do DNA celular ou dependendo da cepa pode ocorrer lise celular. Nesse trabalho nós descrevemos o uso do promotor &lambda;PL para expressão constitutiva, isto é, sem a regulação do repressor. Nós otimizamos diferentes condições de cultura para aumentar a secreção no espaço periplásmico de Escherichia coli de cinco proteínas: o hormônio do crescimento humano (hGH), que tem sido amplamente utilizado no tratamento de crianças com deficiência e/ou resistência ao hGH, síndrome de Turner, entre outras desordens; prolactina humana (hPRL), um hormônio polipeptídico conhecido por estimular a lactação e por exercer ação regulatória no crescimento e na diferenciação da glândula mamária, dois antagonistas de hPRL, estudados como potenciais fármacos para o tratamento de alguns tipos de cânceres e por fim o interferon &alpha;2a (IFN-&alpha;2a), que é uma citocina produzida pelas células, em resposta a diferentes estímulos, incluindo ácidos nucléicos virais, células estranhas (particularmente as neoplásicas), antígenos de bactérias, protozoários e vírus. No caso do IFN-&alpha;2a, essa citocina de alto valor agregado e de importante aplicação terapêutica, foi desenvolvida em nosso laboratório como parte desse trabalho, incluindo o desenvolvimento e a validação da metodologia de análise por HPLC de fase reversa para determinação do IFN presente no fluído periplásmico bacteriano ou na sua forma pura. As principais estratégias utilizadas para melhorar a expressão foram iniciar a indução junto à densidade óptica máxima do crescimento bacteriano e otimizar a temperatura de indução para controlar a expressão da proteína heteróloga. Essa metodologia pode ser utilizada nos casos onde o produto não será tóxico para a célula hospedeira ou quando a instabilidade do plasmídeo não é problema. A possibilidade de cultivo em temperaturas mais baixas, já que o repressor termo-sensível não se encontra presente, colaborou para o aumento significativo da expressão, mesmo para proteínas menos sensíveis à temperatura de cultivo, como o hGH.

Palavras-Chave: recombinant dna; proteins; escherichia coli; sth; lth; peptide hormones; plasmids; chromatography

PEREZ, FERNANDA dos S.A. Influência da temperatura de cultivo na expressão de proteínas recombinantes de interesse terapêutico no espaço periplásmico bacteriano, utilizando o promotor lambda PL. Orientador: Carlos Roberto Jorge Soares. 2015. 87 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2015.tde-19102015-150711. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/25195. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Queratinócitos são um veículo bastante atrativo para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. Um eficiente vetor retroviral (LXSN) contendo o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foi utilizado para transduzir queratinócitos humanos primários. Os queratinócitos transduzidos apresentaram um nível de secreção in vitro alto e estável atingindo até 11 g mGH/106 células/dia. Os epitélios formados por estes queratinócitos geneticamente modificados apresentaram, porém, uma queda na taxa de secreção > 80 % quando foram retirados da placa de cultura utilizando um procedimento clássico. A substituição desta metodologia clássica por uma cultura organotípica resolveu completamente este problema. Camundongos anões imunodeficientes (lit/scid) implantados com estes enxertos organotípicos foram acompanhados durante 4 meses, e apresentaram um aumento de peso significativo (P<0,05) nos primeiros 40 dias. Níveis circulatórios de mGH atingiram um pico de 21 ng/mL 1 h após o implante, mas estes níveis rapidamente atingiram níveis basais (~2 ng/mL). Os queratinócitos humanos primários apresentaram portanto altos níveis de expressão in vitro e os maiores níveis circulatórios, porém por um breve período de tempo, reportados até o momento para GH neste tipo de células. Em conjunto com resultados que mostraram uma recuperação considerável da eficiência de secreção de mGH em cultura por enxertos organotípicos retirados dos animais, foram discutidos os fatores que ainda impedem a utilização clínica deste modelo promissor de terapia gênica cutânea.

Palavras-Chave: gene therapy; proteins; keratin; mice; animal growth; animal cells; sth; epidermis

CECCHI, CLAUDIA R. Secrecao de hormonio de crescimento de camundongo por queratinocitos humanos primarios: perspectivas para um modelo animal de terapia genica cutanea. Orientador: Cibele Nunes Peroni. 2008. 61 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, Sao Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2008.tde-31082009-150915. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11725. Acesso em: $DATA.

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