Abstract: A radiação ionizante tem sido empregada com sucesso na modificação das propriedades imunológicas das biomoléculas e tem se mostrado uma potente ferramenta para destoxicar venenos de serpentes sem afetar e, muitas vezes, melhorando suas propriedades imunogênicas. Resultados promissores foram obtidos com o tratamento, tanto de veneno total quanto de frações isoladas, com a radiação gama de 60Co. No presente trabalho, foram avaliados os efeitos da Bothropstoxina-1 (Bthx-1) e do veneno total de Bothrops jararacussu sobre o sistema imune de camundongos B10.PL e BALB/c, visando caracterizar a resposta imune contra proteínas irradiadas. Modificações estruturais foram observadas por meio de técnicas eletroforéticas - SDS-PAGE. Para os ensaios imunológicos, camundongos de diferentes linhagens foram imunizados com ambas as formas da Bthx-1 e os anticorpos circulantes foram isotipados e titulados pelo método de ELISA. Os resultados mostraram que tanto o veneno total como a toxina isolada, mesmo após o processo de irradiação, se mostraram imunogênicos e os anticorpos produzidos reconheciam as formas nativas. Para a caracterização antigênica a técnica de Western Blot permitiu demonstrar que a Bthx-1 irradiada induziu à produção de anticorpos responsivos para ambas as formas da toxina isolada e do veneno total. Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostram que a viabilidade dos macrófagos ensaiados com a Bthx-1 ou com o veneno total irradiados foi maior quando comparada com os resultados obtidos para as formas nativas. Analisando-se o resultado do ensaio de LDH, observou-se que a Bthx-1 irradiada promoveu menor dano muscular que a toxina nativa. Conclui-se que a irradiação de proteínas promove modificações estruturais significativas, mantendo, contudo, suas propriedades imunológicas originais, representando uma potencial ferramenta na melhoria do processo de imunização.

Palavras-Chave: ionizing radiations; cobalt 60; biological radiation effects; enzyme immunoassay; immunity; venoms; snakes

CAPRONI, PRISCILA. Acao da Bothrospstoxina-1 do veneno total de Bothrops jararacussu irradiados sobre o sistema imune. Orientador: Nanci do Nascimento. 2009. 59 f. Dissertacao (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, Sao Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2009.tde-29062009-145047. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11518. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Considerando os efeitos da radiação gama sobre proteínas e a capacidade do sistema imune de reconhecer macromoléculas modificadas, decidimos avaliar alguns aspectos imunológicos de camundongos B10.PL frente a ovalbumina e bothropstoxina–1 (BTHX-1), nas formas nativa e irradiada. Para avaliar prováveis modificações estruturais nas moléculas das proteínas após o processo de irradiação (radiação gama de 60Co), foi realizada a eletroforese em gel de poliacrilamida 15% para a ovalbumina e para a BTHX-1, nas formas nativa e irradiada. A ovalbumina também foi submetida à cromatografia de exclusão molecular, enquanto a BTHX-1 foi submetida à espectrometria de massa. Os resultados destes ensaios mostraram que a radiação gama foi capaz de promover alterações nas moléculas de ovalbumina e BTHX-1. A fim de avaliar a toxicidade da BTHX-1 irradiada em relação à nativa realizou-se um ensaio de citotoxicidade celular em células CHO. O resultado mostrou que a toxina na sua forma irradiada apresentou, aproximadamente, cinco vezes menos toxicidade do que a toxina na sua forma nativa. Com relação aos aspectos imunológicos, foram realizados ensaios de produção e identificação de anticorpos, nos quais, os animais foram imunizados com ovalbumina e BTHX-1, nas formas nativa ou irradiada. Observou-se que as proteínas nativas induziram, preferencialmente, uma resposta do tipo Th2, enquanto que as proteínas irradiadas induziram uma resposta do tipo Th1. Realizou-se um ensaio de proliferação celular para avaliar o comportamento de esplenócitos, retirados do baço de camundongos B10.PL, imunizados com ovalbumina e BTHX-1, nativas ou irradiadas, cultivados em presença de ambas as formas das proteínas. Em relação à ovalbumina, os resultados mostraram que tanto as células dos animais imunizados com a ovalbumina nativa como aquelas dos animais imunizados com a proteína na sua forma irradiada apresentaram crescimento semelhante. No caso da BTHX-1, os resultados mostraram que as células dos animais imunizados com a toxina irradiada foram capazes de reconhecer a forma nativa da toxina, pois apresentaram crescimento semelhante ao das células dos animais imunizados com a BTHX-1 nativa.

Palavras-Chave: proteins; antigens; ionizing radiations; immunology; venoms; detoxification

ALVES, JANAINA B. Aspectos da resposta imune frente a antigenos proteicos irradiados com sup(60)Co. Orientador: Nanci do Nascimento. 2004. 47 f. Dissertacao (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP, Sao Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2004.tde-04012005-195057. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11183. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Os acidentes ofídicos representam um sério problema de Saúde Pública, principalmente em países subtropicais. No Brasil, segundo o Ministério da Saúde, foram notificados cerca de 26 000 acidentes em 2008. O gênero Crotalus (cascavéis) é responsável por aproximadamente 7% do total, porém apresenta um alto índice de letalidade, sendo que 72% dos casos de acidentados sem o tratamento adequado com soro específico (soro anticrotálico) chegam ao óbito. A produção de soro no Brasil, único tratamento eficaz nos casos de acidentes ofídicos, utiliza equinos que, apesar do grande porte, apresentam diminuição da longevidade quando comparado com os cavalos não imunizados. A radiação ionizante tem se mostrado como excelente ferramenta na diminuição da toxicidade de venenos e toxinas isoladas e tem resultado na obtenção de melhores imunógenos para a produção de soro, além de contribuir para o bem estar dos animais soro-produtores. Visto que a ação da radiação gama em toxinas ainda não está totalmente esclarecida do ponto de vista estrutural, foi proposto neste trabalho, a caracterização de duas proteínas da espécie Crotalus durissus terrificus: a crotoxina e a crotamina. Após o isolamento das toxinas de interesse por técnicas cromatográficas, estas foram submetidas às análises estruturais com a aplicação das seguintes metodologias: Fluorescência, Dicroísmo Circular, Calorimetria Diferencial e Espectroscopia Infravermelho. Estas análises mostraram que tanto a crotamina como a crotoxina, quando submetidas à radiação gama, apresentaram alterações na conformação estrutural em comparação com as amostras no estado nativo. Tais alterações possivelmente ocorrem na estrutura terciária e secundária das proteínas e podem explicar as modificações quanto à atividade biológica destas toxinas.

Palavras-Chave: snakes; venoms; ionizing radiations; immune serums; fluorescence; calorimetry; infrared spectra; spectroscopy; molecular structure

OLIVEIRA, KARINA C. de. Aspectos estruturais de proteinas do veneno crotalico modificado por radiacao ionizante. Orientador: Nanci do Nascimento. 2010. 101 f. Dissertacao (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, Sao Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2010.tde-12082011-092929. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/9501. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Os venenos de serpentes são alvos de pesquisas constantes, pois possuem 90 a 95% do seu peso seco em proteínas que exercem diversas atividades fisiológicas em suas presas. As espécies do gênero Crotalus estudadas no presente trabalho possuem venenos capazes de induzir alterações neurotóxicas, miotóxicas e causam distúrbios de coagulação no caso do veneno de Crotalus vegrandis. A crotamina é um peptídeo catiônico proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus, com atividade miotóxica e antimicrobiana já descritas. O trabalho avaliou a atividade antimicrobiana de crotamina e crotamina-símile provenientes do veneno de serpentes do gênero Crotalus. O veneno bruto foi fracionado por três diferentes métodos cromatográficos, e, para avaliar a técnica, utilizou-se SDS-PAGE. Na etapa de identificação e caracterização de crotamina, foi feito ELISA, utilizando como anticorpo primário uma IgG policlonal anti-crotamina. A fim de analisar a atividade antimicrobiana foram realizados os ensaios de difusão em gota e CIM (Concentração inibitória mínima). A citoxicidade em células murinas, foi avaliada por MTS. A purificação por duas etapas cromatográficas foi suficiente para observarmos a presença da crotamina e crotamina-símile puras (SDS-PAGE). Foram identificados dois peptídeos promissores com relação à atividade antimicrobiana no veneno de C. vegrandis. Todas as amostras testadas foram imunorreativas. Os peptídeos apresentam atividade antimicrobiana com diferentes especificidades e potências. Não houve alta toxicidade frente à linhagem celular murina, apresentando-se como um futuro protofármaco.

Palavras-Chave: snakes; venoms; antimicrobial agents; peptides; antibodies; enzyme immunoassay; toxicity; chromatography

MESSIAS, MARCELA Di G. Atividade antimicrobiana de crotamina e crotamina-símile proveniente do veneno de serpentes do genêro Crotalus. Orientador: Patrick Jack Spencer. 2017. 61 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2018.tde-19092018-142633. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/29430. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A produção de soro no Brasil, único tratamento eficaz nos casos de acidentes ofídicos, utiliza equinos que apesar do grande porte, apresentam diminuição da longevidade quando comparado com os cavalos não imunizados. A radiação ionizante tem se mostrado como excelente ferramenta na diminuição da toxicidade de venenos e toxinas isoladas, além de promover a obtenção de melhores imunógenos para a produção de soro. Sabe-se, contudo, que os efeitos da radiação ionizante em materiais protéicos caracterizam-se por diversas alterações químicas, como fragmentação, cross-linking, agregação e oxidação devido aos produtos gerados pela radiólise da água. Porém, a ação da radiação gama em toxinas ainda não está totalmente esclarecida do ponto de vista estrutural e farmacológico, fato que impede a aplicação de tal metodologia no processo de produção do soro. Assim, foi proposto nesse trabalho a caracterização da crotamina, uma das principais proteínas do veneno da espécie Crotalus durissus terrificus, irradiada com raios gama de 60Co. Após o isolamento da toxina por técnicas cromatográficas e a realização de testes para comprovar a obtenção da crotamina pura, a toxina, nos estados nativo e irradiado, foi submetida às análises estruturais de Fluorescência e Dicroísmo Circular. Testes utilizando altas pressões hidrostáticas também foram realizados com o intuito de verificar se as alterações conformacionais causadas pela radiação sofreriam modificações sob altas pressões. Do ponto de vista farmacológico, testes de contração muscular foram realizados com o objetivo de delimitar a ação da crotamina em musculatura lisa, bem como a mudança na ação da toxina frente às alterações estruturais ocasionadas. As análises de Fluorescência e Dicroísmo Circular mostraram que há mudanças na conformação da crotamina quando submetida à radiação gama e que tais alterações possivelmente ocorrem na estrutura terciária e secundária da proteína. O observado nos testes farmacológicos mostraram que a crotamina irradiada foi menos eficaz na diminuição da contração muscular do ducto deferente de ratos em comparação com a crotamina nativa. Além disso, o comportamento da toxina irradiada na contração tônica, modulada por noradrenalina, foi distinto daquele observado para a toxina nativa.

Palavras-Chave: snakes; venoms; toxins; gamma radiation; cobalt 60; immune serums; chromatography; fluorescence

OLIVEIRA, KARINA C. de. Caracterização bioquímica e farmacológica da crotamina irradiada por raios gama de Co-60. Orientador: Nanci do Nascimento. 2014. 123 f. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/T.85.2014.tde-17032015-150657. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/23695. Acesso em: $DATA.

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Abstract: A crotamina, um peptídeo catiônico que possui 42 aminoácidos e 4,88 kDa, é proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus. Ela apresenta características que permitem sua forte interação com alvos moleculares e membranas biológicas e assim foi o primeiro peptídeo de veneno a ser classificado como um CPP (cell penetrating peptide), justificando seus importantes efeitos biológicos e suas diversas atividades farmacológicas. A crotamina é descrita por sua atividade miotóxica, tendo como efeito a paralisia e espasmos das patas traseiras de ratos e camundongos. Esse fenômeno é descrito por ações em canais de Na+ e/ou K+ e consequente aumento do influxo intracelular dos níveis do íon Ca2+. Estudos a descrevem como um agente despolarizante utilizando a musculatura esquelética como modelo experimental. Outra atividade descrita da crotamina é um aumento na liberação basal de acetilcolina (ACh) e dopamina no sistema nervoso central de ratos. Até o momento, pouco ou nenhum estudo foi realizado em musculatura lisa. A junção neuromuscular autônoma difere em vários aspectos importantes da já conhecida junção neuromuscular esquelética. O ducto deferente de rato (DDR), um órgão par e tubular pertencente à genitália acessória masculina, foi utilizado como modelo experimental por ser um dos órgãos periféricos mais densamente inervados pelo sistema nervoso autônomo simpático. Esse fato, o torna uma importante ferramenta para estudos que envolvam a neurotransmissão e a ação de drogas adrenérgicas. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da crotamina na contração da musculatura lisa. A crotamina foi isolada a partir do veneno de C. d. terrificus por cromatografia de exclusão molecular seguida de troca iônica. Os estudos em modelos animais foram realizados utilizando o DD (porção prostática) de ratos Wistar com 5 meses de idade entre 350 g (protocolo CEUA 1261/14). O estudo de neurotransmissão foi feito em sistema de órgão isolado (n=6) por estimulação elétrica transmural com tensão de 70V, 3ms de duração em frequências de 0,05 (30 min) e 1; 5 10 e 20Hz (30 seg). A contração isométrica foi registrada em gramas de tensão. Em todos os experimentos a crotamina (0,1;0,5 e 1g/ml) incubada 30 min antes da estimulação. O efeito máximo de contração (Emax) do componente fásico e tônico foi usado como medida. O componente pós-sináptico foi avaliado por meio de curvas dose-resposta de noradrenalina e dose única de ATP (10-3M) na presença ou ausência da crotamina. A diferença estatística foi avaliada pelo teste-t de student (P0,05). Os ensaios de estimulação elétrica de baixa frequência (0,05Hz) revelaram que a crotamina (0,1 e 0,5g/ml) promoveu uma diminuição da contração do DDR (95,7±4,6% e 85,4±5,9%, respectivamente) enquanto que na dose de 1 g/mL de crotamina este efeito não foi significativo. Na curva de freqüência observamos também com as mesmas concentrações de crotamina uma tendência à diminuição da contração fásica e tônica enquanto que a dose de 1 g/mL promoveu um aumento na contração fásica na freqüência de 20,0Hz ((3,2±0,3) em relação ao controle (2,2±0,2). O componente pós-sináptico não foi alterado pela crotamina conforme evidenciado pela curva concentração-resposta de noradrenalina e concentração única de ATP. Com base nos resultados obtidos, concluímos que a crotamina atua apenas no componente pré-sináptico da contração do DDR, provavelmente interferindo na neuroliberação de ATP e noradrenalina. Ela apresenta um efeito bifásico, dependendo da dose utilizada, inibindo ou potencializando a resposta, efeito semelhante ao da -defensinas, uma proteína cuja estrutura se assemelha bastante com a da crotamina.

Palavras-Chave: rats; in vitro; muscles; contraction; sympatholytics; drugs; membrane proteins; targets; process development units; autonomic nervous system agents; autonomic nervous system; toxins; venoms; peptides; site characterization; ion exchange chromatography

EL-CORAB, MARIANA D.M.K. Caracterização da crotamina e seu efeito sobre a contratilidade da musculatura lisa do ducto deferente de rato. Orientador: Patrick Jack Spencer. Coorientador: Cláudio Fontes Souza. 2015. 58 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2017.tde-09012017-111213. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/28041. Acesso em: $DATA.

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Abstract: Os venenos das serpentes são compostos protéicos complexos com extensas atividades biológicas. Estas moléculas abrangem até 95% do peso seco do veneno, e compreendem enzimas, toxinas não enzimáticas e proteínas atóxicas. Dentre as complicações fisiológicas, a Insuficiência Renal Aguda - IRA é bem comum nos acidentes crotálicos, onde as concentrações renais do veneno se apresentam até 50% maiores do que na concentração plasmática. A fração tóxica responsável por essa complicação é a crotoxina. O veneno das serpentes, quando irradiado com raios gama de 60Co, tem a sua toxicidade diminuída, entretanto, são mantidas as suas propriedades imunológicas. Nossa hipótese é que a utilização de veneno irradiado em substituição ao nativo pode reduzir a taxa de lesões renais em animais de grande porte durante a produção de soros antiofídicos, propiciando melhor qualidade de vida e bem estar desses animais. No presente estudo realizou-se o isolamento da crotoxina por técnicas cromatográficas, a partir do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus. Parte da toxina isolada foi reservada e denominada crotoxina nativa (CTXN) enquanto que outra parte foi irradiada com 2 kGy de raios gama oriundos de uma fonte de 60Co e denominada crotoxina irradiada (CTXI). Diferentes grupos de camundongos Balb/c receberam a toxina nativa ou irradiada e tiveram seus rins removidos em diferentes tempos pós-injeção da crotoxina. Realizou-se a nefrectomia dos animais e foi feito o preparo dos cortes histológicos em Hematoxilina-Eosina (HE) e cortes de imunohistoquímica com anticorpo policlonal de coelho anticrotoxina. As alterações histopatológicas encontradas nas amostras foram glomerulonefrite (GN), congestão capilar (CC) e necrose tubular aguda (NTA). Verificou-se que a GN teve maior ocorrência no grupo CTXN que no grupo CTXI. A NTA foi dominante no grupo CTXN em relação ao grupo CTXI. A CC foi predominante no grupo CTXI que no grupo CTXN. Entretanto esta diferença não é estatisticamente significante segundo o teste t Student de amostras independentes. O tratamento imunohistoquímico revelou que a concentração de antígeno marcado com o anticorpo é decrescente segundo os intervalos de tempo de eutanásia dos animais do grupo inoculado com CTXI, pois a crotoxina quando irradiada tem a sua excreção renal facilitada. Conclui-se que as alterações histopatológicas GN e a NTA foram significativamente menos frequentes em rins de animais inoculados com CTXI. Diferentemente da crotoxina nativa, a crotoxina irradiada é detectada pelo anticorpo anticrotoxina apenas nos tempos intermediários pós-inoculação e em baixa concentração, indicando que a radiação gama promoveu mudanças na forma de ligação da toxina ao tecido renal, facilitando sua eliminação e diminuindo, portanto, as chances de lesão. Esses resultados reforçam as evidências de que o uso de veneno irradiado no processo de imunização garante uma melhor qualidade de vida e bem estar aos animais soroprodutores.

Palavras-Chave: snakes; venoms; toxins; kidneys; failures; biological effects; mice; gamma radiation; cobalt 60; comparative evaluations

ROCHA, ANDRE M. Comparação entre a nefrotoxicidade da crotoxina nativa e a irradiada com raios gama de Co-60 em camundongos. Orientador: Nanci do Nascimento. 2016. 68 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: 10.11606/D.85.2016.tde-03032016-091711. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/26084. Acesso em: $DATA.

Esta referência é gerada automaticamente de acordo com as normas do estilo IPEN/SP (ABNT NBR 6023) e recomenda-se uma verificação final e ajustes caso necessário.

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