INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES
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Navegação Eventos - Resumos por título da publicação "Optimization of the process of expression in E. coli and purification of the catalytic sites of the ACE1 by the ELP-Intein system"

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  • IPEN-DOC 29545

    PRATA, BEATRIZ A. ; SANTOS, CAROLINA M. dos ; AFFONSO, REGINA . Optimization of the process of expression in E. coli and purification of the catalytic sites of the ACE1 by the ELP-Intein system. In: ANNUAL MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY (SBBq), 51st; CONGRESS OF BRAZILIAN BIOPHYSICAL SOCIETY (SBBf)/LATIN AMERICAN FEDERATION OF BIOPHYSICAL SOCIETIES (Lafebs), 46th, September 5-8, 2022, Águas de Lindóia, SP. Abstract... São Paulo, SP: Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular - SBBq, 2022. p. 220-220.

    Abstract: INTRODUCTION: Angiotensin I-converting enzyme (ACE) is a fundamental part of the renin-angiotensin system; this has two domains, N- and C-, each of which has a catalytic site that exhibits 60% sequence identity. Its actions are in the control of blood pressure, protection of the brain by cleavage of beta-amyloid bodies, cell proliferation, formation of hematopoietic stem cells, among others. OBJECTIVES: Obtaining the catalytic sites Ala361 to Gly468 (N domain region, csACEN) and Ala959 to Ser1066 (C domain region, csACEC) in pure form and with their correct structural conformation. MATERIALS AND METHODS: Expression conditions of pE1csACEN and pE1csACEC vectors in E. coli BL21(DE3) strain: cultures grown in Terrific Broth at 37⁰C at 140 rpm for 20–24 h and 0.1 mM IPTG. Purification by Elastin-like Polypeptide (ELP) precipitation: ELP-bound catalytic sites were purified with two ammonium sulfate precipitations (ASp). Remotion of ELP: by autocleavage of the Intein sequence using the buffers: sodium phosphate, sodium cacodylate, MES and Tris-HCl. The ELP/Intein was removed from the sample by ASp. The analyzes of all stages of the process were performed by SDS-PAGE and Dot blotting. DISCUSSION AND RESULTS: The differential for obtaining the pure peptides was the temperature of 37⁰C, with a significant increase in expression concerning the cultivation of 16⁰C. In the ELP purification steps, ammonium sulfate buffer concentrations of 0.57 M and 0.8 M were the most efficient. Intein's self-cleaving was more efficient with MES buffers and Tris-HCl for ELPsACEN and ELPsACEC, respectively. Structural analysis by Circular Dichroism and Fluorescence confirmed the correct structure of the pure peptides. CONCLUSION: In the present work, we defined the most efficient conditions for expression, purification, and obtaining of ACE catalytic sites in pure form. The csACEN and csACEC peptides will allow greater assertiveness in obtaining and characterizing new hypertensive drugs and in the hydrolysis of substrates such as beta-amyloid.

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O gerenciamento do Repositório está a cargo da Biblioteca do IPEN. Constam neste RI, até o presente momento 20.950 itens que tanto podem ser artigos de periódicos ou de eventos nacionais e internacionais, dissertações e teses, livros, capítulo de livros e relatórios técnicos. Para participar do RI-IPEN é necessário que pelo menos um dos autores tenha vínculo acadêmico ou funcional com o Instituto. Nesta primeira etapa de funcionamento do RI, a coleta das publicações é realizada periodicamente pela equipe da Biblioteca do IPEN, extraindo os dados das bases internacionais tais como a Web of Science, Scopus, INIS, SciElo além de verificar o Currículo Lattes. O RI-IPEN apresenta também um aspecto inovador no seu funcionamento. Por meio de metadados específicos ele está vinculado ao sistema de gerenciamento das atividades do Plano Diretor anual do IPEN (SIGEPI). Com o objetivo de fornecer dados numéricos para a elaboração dos indicadores da Produção Cientifica Institucional, disponibiliza uma tabela estatística registrando em tempo real a inserção de novos itens. Foi criado um metadado que contém um número único para cada integrante da comunidade científica do IPEN. Esse metadado se transformou em um filtro que ao ser acionado apresenta todos os trabalhos de um determinado autor independente das variáveis na forma de citação do seu nome.

A elaboração do projeto do RI do IPEN foi iniciado em novembro de 2013, colocado em operação interna em julho de 2014 e disponibilizado na Internet em junho de 2015. Utiliza o software livre Dspace, desenvolvido pelo Massachusetts Institute of Technology (MIT). Para descrição dos metadados adota o padrão Dublin Core. É compatível com o Protocolo de Arquivos Abertos (OAI) permitindo interoperabilidade com repositórios de âmbito nacional e internacional.

1. Portaria IPEN-CNEN/SP nº 387, que estabeleceu os princípios que nortearam a criação do RDI, clique aqui.


2. A experiência do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN-CNEN/SP) na criação de um Repositório Digital Institucional – RDI, clique aqui.

O Repositório Digital do IPEN é um equipamento institucional de acesso aberto, criado com o objetivo de reunir, preservar, disponibilizar e conferir maior visibilidade à Produção Científica publicada pelo Instituto, desde sua criação em 1956.

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A elaboração do projeto do RI do IPEN foi iniciado em novembro de 2013, colocado em operação interna em julho de 2014 e disponibilizado na Internet em junho de 2015. Utiliza o software livre Dspace, desenvolvido pelo Massachusetts Institute of Technology (MIT). Para descrição dos metadados adota o padrão Dublin Core. É compatível com o Protocolo de Arquivos Abertos (OAI) permitindo interoperabilidade com repositórios de âmbito nacional e internacional.

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